发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记（十九）
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 11 02:59:49 2006), 转信


　本文献给YL

（十九）崭新的世界

六月八号晚上的讲座是由来自Texas MD Anderson Cancer Center的Richard
Behringer作的，主题是Transgenics and insertional mutants。Richard在做基因敲
除和转基因小鼠方面非常有经验，作这个报告再合适不过了。提到Richard Behringer
，我这里向做基因敲除的同学推荐一本他参与编写的书，“Mouse Phenotypes: A
Handbook of Mutation Analysis”。这本书写得极其清楚易懂，既涵盖了基因敲除老
鼠的要点和细节，又详细解释了如何对突变体进行表型分析。

言归正传，先谈谈转基因小鼠的历史背景吧。不夸张的讲，转基因小鼠技术的出
现，使得以小鼠为模型的研究进入到一个崭新的世界。有人甚至认为转基因小鼠技术的
出现是人类文明发展的一个里程碑。转基因小鼠的实验技术可以追溯到1966年，加州大
学旧金山分校的Teh Ping Lin在Science 杂志上发表文章，报道说可以显微注射牛丙种
球蛋白溶液到小鼠受精卵的前核（pronuclei）里，如果把这样的受精卵放回到代孕小
鼠体内，还能正常发育成胎儿。这个实验可谓是非常超前，因为六十年代还没有重组
DNA技术，但是正是这个实验证明了技术上向小鼠胚胎引入外源物质的可行性。在那个
时候看，把蛋白质溶液打到小鼠受精卵里，似乎是一个毫无意义的实验，好在Science
还比较有远见，接受了这篇文章。又过了八年时间，MIT的Jaenisch实验室把提纯的
SV40 DNA注射到小鼠囊胚（blastocyst）的空腔里，最后得到的小鼠体细胞组织里面含
有SV40的DNA序列。这是第一个向小鼠胚胎中导入外源DNA的例子。又过了两年，1976年
，同样这个实验室发现如果用反转录病毒感染四细胞或者八细胞期的小鼠胚胎，病毒的
基因组可以整合到小鼠的生殖细胞里。用病毒来向小鼠胚胎引入外源DNA的办法并没有
很普及。又过了四年时间，到了1980年，Ralph Brinster和同事把信使RNA注射到小鼠
受精卵里，发现可以翻译成蛋白质。随后耶鲁大学的Jon Gordon把外源DNA注射到小鼠
受精卵的前核（pronuclei）中，并发现发育出来的小鼠体细胞组织中带有这个外源的
DNA。转基因小鼠技术到此时才正式成形。又过了一年，又有好几个实验室用同样的办
法将外源DNA整合到小鼠基因组里。有的实验室还发现整合到小鼠的外源基因可以遗传
到下一代，说明小鼠的生殖细胞中也整合了外源基因。事实上，把外源基因导入动物并
不希奇，但如果能传给后代，就很不容易了。另外，不为人知的是，动物转基因技术首
先是在小鼠身上实现的。转基因小鼠技术的出现是一件大事，这也是为什么Watson建议
在冷泉港开设小鼠课程的原因。这个小鼠课程最开始设立，就是为了传授转基因中的核
心技术，前核显微注射（pronuclear injection）。

前核显微注射（pronuclear injection）的具体操作过程我会在以后的篇章中介
绍。上一篇讲小鼠胚胎的着床前发育，提到卵子刚受精的时候，来自卵子和精子的DNA
分别解聚，但还没有融合在一起，而是分离的两个小核，称为前核（pronuclei）。前
核显微注射就是把线性的DNA注射其中一个前核中，使之整合到小鼠基因组中。Richard
Behringer讲了很多转基因小鼠的技术细节和窍门。随便举几个例子：（１）只有线性
的DNA才能整合到基因组里，但有些时候如果只希望在受精卵里瞬时表达一个基因，就
可以注射supercoil DNA；（２）注射进入前核的DNA浓度不能太高，理想浓度是１到２
ng/ml，而用来稀释DNA的缓冲液是10mM Tris pH7.4, 0.1-0.3mM EDTA；（３）有人试
过注射到细胞质里，问题是效率不高，且受精卵容易死。同时远系小鼠的受精卵做前核
显微注射存活率较高。（４）注射进入的DNA最好是genomic sequence，因为cDNA表达
得不好。

必须强调的是，转基因的过程，外源DNA的整合位点是随机的。由于同源重组的关
系，理论上可以直接用前核显微注射的办法来做基因敲除。但问题是同源重组效率非常
低，随机整合的几率要比同源重组几率大很多。Richard Behringer提到有人这么试过
，显微注射了一万个受精卵，有将近两千个顺利发育成小鼠。其中只有五百只是转基因
小鼠，而只有一只是定点同源重组的小鼠！

更多的技术细节，大家可以参考Manipulating Mouse Embryo: a laboratory
manual, third edition。


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