发信人: Oncogene (基因头), 信区: Biology
标 题: [合集] 请问关于荧光染色
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Sep 18 10:10:02 2006), 站内

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icepiao (icepiao) 于 (Sun Sep 17 00:44:40 2006) 提到:

我转染后利用Anti-V5-FITC进行荧光染色，买的是invitrogen的抗体，目的是看
plasmid transfection后一个protein的表达情况，V5是该蛋白的Fusion protein tag
，因此只要该protein表达，理论上V5应该也表达，基因的启动子是CMV启动子。
步骤为首先co-transfection，利用另外一个report plasmid看transfection
efficiency, 48小时后PBS洗两遍，利用100%甲醇固定5min,然后PBS洗5遍，2min每次，
加入含10%胎牛血清的PBS Block20分钟，然后加入荧光抗体，置暗处1h,然后荧光显微
镜下观察，但是在荧光显微镜下几乎什么也看不到，偶尔有几个有可能有荧光的细胞，
但是太少了。
随后我也采用了4% PFA fix 0.1%Triton x-100 permeabilize, 依旧看不到荧光。
按理说，免疫荧光应该比较好出来吧，不知道哪里出了问题了，是不是做
immunoflorence有一些trick我没有