发信人: adeno (天夺其魄), 信区: Biology
标 题: Re: 目前最常用的点突变方法是什么?
发信站: The unknown SPACE (Tue Jun 11 00:20:51 2002) WWW-POST

not really, you have actually same # of steps as 2-step PCR

One step: PCR----DpnI-----Self ligation
two step: PCR----PCR---TA cloning

And actually your steps are more tricky, if you consider that Pfu has low
processivity while you have to PCR the full length of the plasmid which is at
least 3kb, you didn't really save time; and also compared to the efficiency
of 2-step which is 100%, the efficiency of your method is low; another
consideration may not be so important to you. you have to buy expensive kit to
do this, while 2-step cost almost nothing.


【 在 gzip (好好睡一觉) 的大作中提到: 】
: 其实也不必用两步PCR啦。
: 偶们用一步PCR，引物设计跟你说的一样，Pfu扩第一步，PCR产物用DpnI切。DpnI专切
甲
: 基化的DNA，
: 这样PCR合成的DNA不会被切，而模板被切掉。切完直接转到大肠里就行了。
: 在偶手里一般是>80%。在偶领导手里是100%，呵呵。
: 一步的好处就不用我说了吧。
:
: 【 在 akite (找路的人) 的大作中提到: 】
: : to my experience, the efficiency is 100%, if you can get both first-step
: : products correctly.
: : the trick is the 3' end of the front part and the 5' end of the rear part
: are
: : the same, notice my first sentence, "a pair of COMPLEMENTARY primers", so
in
: : the first annealing round of the 2nd PCR, the two templete DNA molecules
: : anneal, in the first elongation round, both annealed chains elongate to
the
: : end and get the full lenth gene. in the next steps, just normal PCR le.
: :
: : 【 在 aoexy (lili) 的大作中提到: 】
: : : then how about the effciency? How does it happen since the template DNA
: are
: : : two separate one?
: : :
: : : 【 在 akite (找路的人) 的大作中提到: 】
: : : : 偶用的是two-step PCR, 把要突变的点设计在一对互补的引物上，最好在中间，
第
: 一
: : 步
: : : 用
: : : : normal ５' primer+mutant 3'primer以及mutant 5'primer+normal 3'primer分
别
: 得
: : 到
: : : 基
: : : : 因前段和后段的PCR产物，第二步用正常的5' and 3' primers
: : 做引物，以第一步PCR的
: : : 两
: : : : 个产物为模板，得到含有突变的全长DNA，再clone到质粒上拿去测序鉴定就行乐
。
: : : :
: : : : 【 在 zzzzh (happy) 的大作中提到: 】
: : : : : 最好是用在酵母遗传学中的
: : : : :
: : : :
: : :
: : :
: :
:
:

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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 128.249.150.130]