发信人: golem (骚客狗愣), 信区: Biology
标 题: Re: 各位都是用的哪个公司的Pfu Poly?
发信站: The unknown SPACE (Sat Jul 27 08:12:04 2002) WWW-POST

其实没必要控制cycle，虽然书上这么建议的。
俺先后用过两个proofreading，先是用NEB的Deep Vent,这个酶的忠实度狠好，俺用来构
建质粒，35cycles,将近1k的三个片段拿去测序，没有错误。
后来作RT PCR的时候因为template是total poly A RNA，而Deep Vent没有Hot start，结
果不是太consistant，有时候有，有时候没有，产率也偏低。俺就换到Pfx plantium
(Invitrogen)，号称市面上忠实度最高的，现在所有RT PCR都作出来了，35cycles,3K的
片段。先拿了一个基因的三个克隆测序，结果是在两端大致1.5k的长度上DNA序列有2-4个
错误，氨基酸序列没有错误。而且由于俺同时测了三个克隆，以后可以用没有错误的克隆
拼接成error free的一个全长片段。
总的来说，Mg的浓度不要太高，酶的用量要尽可能少，然后就是wait and pray了，呵和
。
好运！


【 在 Oncogene (癌基因) 的大作中提到: 】
: RT-PCR后需要产物来做SUBCLONING，
: PFU显然是首选，
: 但活性简直与TAQ差了十万八千里，
: 不知道各位是如何解决的？
:
: 老板告诉我说CYCLE数要控制在25之内，
: 不知道是否真的如此重要？
:
: 谢了！
:

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一个人只拥有今生今世是不够的,他还应该拥有诗意的世界.

※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 128.8.]