发信人: tops (digging), 信区: Biology
标 题: Re: 紧急求助
发信站: The unknown SPACE (Sun Aug 25 12:10:36 2002) WWW-POST

我用one fly prep做过几次不同的PCR, 都一次PCR拿到target。

一直用这个website设计引物：
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

我一般用20bp左右的引物， 带GC clamp(3'末端是C或G)1-2个。
最好2个GC clamp. Tm 60C左右, 最后PCR的退火温度也是60C.

设计好引物后，到这里来去除不合适（hairpin, self-dimer)的引物。
http://www.idtdna.com/program/oligocalc/oligocalc.asp

good luck!

【 在 dh (dh) 的大作中提到: 】
: thanks for your reply.由于两个primer Tm 相差10度，所以作了grading 分别是50，
55
: degree，60，65，70. The 70 degree group seems has something.
: 【 在 tops (digging) 的大作中提到: 】
: :
: : 会不会是annealing temperature太高了，
: : 有没有做过annealing temperature gradient?
: : 【 在 dh (dh) 的大作中提到: 】
: : : I use Takara several times. It's true it gives some product but too
thin.
: How
: : : about elongase and Pfx they are prove reading. But once I use Pfx the
: product
: : : is smeared. I don't know why.
: : : 【 在 golem (狗愣小岩) 的大作中提到: 】
: : : : try PCR enzyme (Takara Ex Taq) from Takara, I used it for genomic DNA,
: never
: : : : failed so far.
: : : 很
: : : : 淡
: : :
: 的带。其间换了4对primer，结果差不多。因现在PCR结果总不稳定，不能作ligation.
: : : : 请
: :
: :
:
:


--
实验总是做不完的,
老婆可只有一个...





※ 修改:·tops 於 Aug 25 12:10:36 修改本文·[FROM: 128.6.]
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 128.6.]