发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: Re: DNA Ligation problem
发信站: The unknown SPACE (Tue Feb 11 22:32:08 2003), 站内信件


几个小建议：
(1) 去磷酸化不是那么重要。
(2)换新的连接酶尤其是新的BUFFER。连接反应的BUFFER
非常容易坏，因为里面有ATP，冻融几次就不行了。
(3)载体和插入片段的量要足够。建议插入片段的量越多
越好。我一般让片段的莫尔量是载体的几十倍。
(4)既然你用琼脂糖凝胶纯化你的片段。我估计你用UV照射过
胶来确定位置，然后切下有DNA的部分，是吧？UV照射下，
很容易让DNA形成嘧啶二聚体，急剧降低连接效率。所以你要么
不用gel purification，如果必须分离两个片段，你可以
同时在两条LANE上跑少量的DNA和大量的DNA，切下少量DNA的
胶用UV照射确定所要片段的位置。

【 在 victorjenny (victor) 的大作中提到: 】
: I digested separately, then isolated from gel, then ligated.
: 【 在 adeno (天夺其魄) 的大作中提到: 】
: : Don't understand, why phosphotase if you are doing 2 cohesive end ligation?
: : Are you using the right buffer? Invitrogen Bf 4 for apaI while 3 for NotI,
: : maybe you should use them separately.
: : never
: : tried
: I
: Reason
: : 1,
: : gel


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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 129.49.]