发信人: xfeng (风儿～西风愁起绿波间), 信区: Biology
标 题: Re: 一个组化问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Feb 11 22:38:12 2003), 站内信件

问题很多，
1, sucrose脱水过夜是不够的，我记得我是10%，20%，30％梯度脱的
好像有点多余，不过直接用30%的脱，中间也要换液。
2, 冷冻很讲究，乙醇干冰最好，实在不行液氮也凑合了，冻得不好就碎了
3, 起皱是贴片的功夫，这个得练，熟了就不起了
4, 本底高看你的操作可能是wash的不够，应该是摇床5min，三次
5, 掉片子是载片处理的不好。先泡酸，然后泡乙醇，最后泡明胶或防脱片剂

【 在 iav (damn it) 的大作中提到: 】
: 做fly的body cryostat sectioning, 用于immunostaining.
: 发现从切片到染色,到处都是问题.
: 切片部分, 按照通常方法,paraformadehyde 固定以后,用sucrose (20%, 12%我也在试)
: 溶液浸泡过夜,然后用OCT compound包埋,先泡10来分钟,然后放-80oC冷冻(protocol里面
: 是用乙醇干冰冷冻,不知道这个差别是不是很大),再-20oC放20分钟,然后切片.
: 看别人的paper,有很漂亮很完整的切片,中间的内容加四周的cuticle都有. 我的片子
: cuticle都切散架了,而且切的过程中切片起皱,波浪形的. 不知道有没有什么trick?
: 切片机有点老,只能切10um以上,我切的是16um/14um. 刀片也没法改,没有更好的对比也
: 感觉不出毛病来,反正是看上去还挺薄挺锋利的. 我想切片前处理可能讲究比较多,还有
: 就是切的时候是不是也有trick.
: 染色也是问题不少. 抗体溶液浸泡,中间的清洗,按部就班,结果还是background 信号太多.
: 一抗是没法换的,二抗换过了 (对了, HRP偶联,goat-anti-rat), 最后用HRP显色剂显色
: 还是到处都是红的. 怀疑wash不干净. 我是直接把有切片的玻片放进溶液里面,泡两分钟
: 拿起来再放进去接着泡两分钟. 也不敢直接用溶液冲洗怕把切片冲丢了. 这个因为也没什
: 么明显的技巧,也想不清楚到底是什么原因. 不过应该还是有些诀窍的吧.
: 没有经验,实验室里也没人能够指点,只好来这里问了.
: 请多指教! 多谢.
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花易落 月难圆
只应花月似欢缘
秦筝算有心情在
试写离声入旧弦

※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 68.162.]