发信人: golem (宝贝小岩), 信区: Biology
标 题: Re: help: Molecualr cloning problem
发信站: The unknown SPACE (Wed Mar 19 11:25:12 2003) WWW-POST

check NEB catalog for Taq enzyme, it has double strand specific 5'->3'
exonuclease activity.
My guess is primer and/or product degradation by Taq.

BTW, one small tip for pfx is: using 2X buffer rather than 1X. I got several
cDNA clones by PCR, and none of them disrupt the ORF by this modification.

【 在 sunnyday (飞鸟) 的大作中提到: 】
: 需要克隆一段很小的DNA(355bp)到pGEX4t1里面，设计的primers为40-42 nt,
: 而且两个5‘端各有大概10~12nt的引入序列(包含引入的restriction sites, 和原
: DNA 不match)，一个site是BamhI,与末端相距5nt,另一个是SalI,距末端8nt.
:
: PCR时因为实验室的pfu和pfx不肯工作，一气之下就用了taq(心想，反正片段小)
: 产品很清晰，就用pcr purification column, 没有跑胶，有少量的template
DNA(WASP)
: 混入。然后用BamhI + SalI 切，克隆进pGEX4t1后tranformation,
然后用同样的primer
: 来做screening PCR, 发现有五个colonies 有大小相符的band (control
colony-pGEX4t1
: 在该位置无band), 将DNA提取出来后做了restriction analysis,然后我就晕倒了。
:
: 晕倒原因： 克隆的片段上面应该带有EcoRI site 和SacI site,
这些在处理后的pGEX4t1
: 中是没有的。然而五个colonies中没有任何一个有这些site;
: 这是怎么回事？
: BamHI 和SalI 分析揭示plasmid的大小符合pGEX4t1的特点，不应该是template
: DNA(wasp)。而且，即使是template 混进去了，也应该有 EcoRI/SacI site呀！
: 即使是Taq 混帐带入了mutation,也不应该五个克隆都mutate 在同一个位置呀？
: 如果说我拿到的全部是母体plasmid pGEX4t1, 没有insert,那怎么解释 screening PCR
: 的结果？
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一个人只拥有今生今世是不够的,他还应该拥有诗意的世界.






※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 128.8.]