发信人: liuxiyan (liuliu), 信区: Biology
标 题: Re: 硫氰酸胍－酚法抽提植物RNA
发信站: The unknown SPACE (Thu May 15 07:44:03 2003), 转信

哦，还是这个提RNA的问题。
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1，蛋白并不会完全分配到酚相中去。酚使蛋白变性，暴露出一部分憎水基团；变性的蛋白
质不再溶于水相而从水相中分离出来。或许蛋白上还有一部分亲水基团，使蛋白象表面活
性剂一样滞留在酚和水的界面？不懂，搞化学的人应该更明白一点。
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2，我只用酸性酚而不加氯仿去抽提样品RNA时，发现整个体系不分相。在抽提质粒时只加
Tris酚不加氯仿体系也能分成清晰的两相 。酸性时，酚的羟基不能电离；碱性时，酚的羟
基才能电离。所以碱性时应该不能分相才对。想不明白。涉及到氢鍵我就更糊涂了，氢鍵
和PH是什么关系？�

3，前面提到在用酸性酚而不加氯仿抽提RNA时体系并不分相，这时即使只加入1/5 体积
的氯仿，酚就可以立刻跑到氯仿中去。是否可以认为在酸性条件下，酚的羟基不能解离
从而不带电荷，于是更容易和氯仿结合。这个我能想通。

4，不管是DNA还是RNA，都是酸性，也就是说等电点<7.pH大于等电点时，核酸带负电，溶
于水相； pH等于等电点时，核酸不带电荷；pH<7时，磷酸骨架和核糖的羟基应该怎样电
离？想不明白。我想他们应该都是不带电的，因此应该不在水相。但是核酸是大分子，事
情是否就不应该这样考虑？事实上我在用酸酚法抽提叶子RNA时经常遇见抽不出来的情况�
我在怀疑RNA是否都跑到酚相中去了。但同样的方法平行实验又能提出别的组织的RNA。想
不明白。真想变成个孙悟空，钻进去瞧瞧到底这么多酚，氯仿，Tris，醋酸，水，DNA，
RNA，蛋白，在一起是怎样纠缠的。哪位大侠有智慧说的清这些事情？

5，其实这许多疑问用kit都可以轻松解决。 还用得着花这多精力？总觉得花这多脑筋不
如想想课题和整体实验设计。
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可惜我没有。

【 在 Marble (小石头哥哥) 的大作中提到: 】
: i am thinking about the general principle for phenol extraction
: of protein from nucleic acid. so phenol has strong hydrophilic
: interaction with protein and protein will be in the phenol phase;
: while phenol has larger density than water, it sits on the bottom
: after centrifugation. chloroform is said to only increase the
: density and does not help too much with phenol extraction, yet
: the last step with chloroform seems to remove trace existence
: of phenol. for tris-buffered phenol (pH8.0), DNA and RNA will
: be in the aqueous phase; for water-buffered phenol (pH4-4.5),
: DNA will be stuck to the mid phase, while RNA remains in the
: supernate. i am wondering how the difference of pH works this
: out. double-stranded DNA is bound to histone, while RNA has
: more opportunity to form hydrogen bonds. but i still could not
: figure out exactly the principle, could anyone help?
: 【 在 golem (小岩鼠) 的大作中提到: 】
: : 其余的全军覆没。并且所有的产物都有大分子DNA的污染。
: : For this method, it has to be pH5.5. Another protocol uses pH8.0, but it's
: : SDS-based, note the difference!
: : I don't think that's important. However, if white stuff is too much, you may
: : want to try more extraction.
: : Should be in your protocol. In general, to remove polysaccharides you need
: : LiCl precipitation after ethanol.


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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 159.226.]