发信人: fever (葡式蛋塔), 信区: Biology
标 题: western战斗的个人心得兼谢各位指点
发信站: The unknown SPACE (Wed May 28 18:40:01 2003) WWW-POST

与western作战了个多月，得到本版很多热心大虾的帮助，最后经过结合多方经验，也挖
了文献出来，终于攻克乐我那个低丰度蛋白PVDF检测堡垒。fever是bench work比较弱的
，这么个小case瞎搞了一个月才搞定，但还是敝帚自珍的总结一下，牛虾们不要笑话，和
偶一样的菜菜们可以吸取俺的教训以后少走弯路。

1. 实验碰到问题，查文献很重要，我最后的关键步骤全部按照查到的方法改进，果然奏
效。动不动跑到这里来撒娇，真是偏劳各位善良的筒子了……

2. 大虾们对PVDF的总结很正确，结合力强，所以也容易提高背景，有效控制背景，主要
是尽量控制一抗的浓度，宁可用最少的一抗4度过夜，不要使用太低的稀释比。（我用的
和大部分文献建议的一样，是1:1000。）二抗在适当的浓度下，温育不要太长，室温1小
时应该足以应付general的需要。

3. 电转膜时间不要over，否则条带可能会有损失（这是偶老板说的，是否为了防止偶在
等转膜期间失踪，则不得而知:）。

4. blocking BSA没有必要用，奶粉就好，像某位大虾说的，又便宜又好用，何乐不为。

5.
tween20可以从头用到尾，但如果用HRP，偶们实验室的惯例是最后一步wash用不含tween
的buffer，因为tween好像干扰反应。tween的浓度，文献上说不要超过0.2%，偶都用0.1%
。




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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 35.10.]