发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: Re: 请问Co-IP中的几个问题
发信站: The unknown SPACE (Sun Jun 8 16:13:36 2003), 站内信件

1. 一般LYSIS BUFFER里头SDS的浓度比较低，最多只有1%，所以
不至於让蛋白质变性，破坏正常的结合能力。不过很难讲，你要
试试。如果你要用lysate做enzyme assay,那就最好不要用SDS，因为
会降低酶活性。

2. 不太清楚，常规的LYSIS BUFFER并不一定需要Sodium fluoride.
查了一下，NaF好像是一种phosphatase的抑制剂。

3. 选择HEPES还是TRIS主要是看在特定pH 附近的缓冲能力。HEPES
是一种酸，用它配pH从5到7.5都还可以，再偏硷性，比如到8，就不是
很好了。TRIS则是一种硷，Pka比HEPES大，配pH8到7之间的缓冲液，
还可以，再偏酸性就不合适了。
如果你要做crosslinking，并且用的是amine coupling的crosslinker,
就不能用TRIS，因为TRIS分子有四个氨基，很容易与crosslinker发生
耦联。


4. 非离子型去垢剂，Nonidet P-40 是最温和的一种。 Triton X-100
也可以。

5. 不太清楚，但是我觉得问题不大。只要你保持低温，又加了足量
蛋白酶抑制剂。我曾用过一个protocol要作过夜Cell lysis.

【 在 worryless (无忧) 的大作中提到: 】
: 1, 在CoImmunoprecipitation之前
: lyse mouse细胞的时候如果在Lysis buffer中加入SDS，
: 会不会影响lysate中蛋白质的bingding能力？
: 2, NaF在IP中的作用是什么？
: 3, 用Hepes还是Tris做lysis buffer好？
: 4，最不会影响蛋白质之间binding的detergenet是什么？
: 5，lyse细胞的时间如果过长(lysis buffer中已经有protease inhibitor的前提下)，
: 比如超过一个小时，会不会对IP造成影响？
:
: 谢谢！


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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 129.49.]