发信人: comeandgo (春困秋乏夏打盹), 信区: Biology
标 题: the way to do itRe: PCR产物酶切一问
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Wed Sep 10 12:53:56 2003) WWW-POST

digestion of PCR product can be very tricky, what i do is following:
1 purify your PCR product with qiagen kit
2 use T4 PNK phosphorylate your PCR product's blunt end
3 ligate your blunt PCR fragment into any vector cutted with blunt end enzyme
(like EcoRV)
4 transformation and mini prep plasmid
5 then use hindIII and EcoRI cut the fragment out of vector
6 purify your hindIII-EcoRI fragment with kit and insert it into the vector
you want to use
this will add one more subcloning step but i am sure it will work

【 在 comeandgo (春困秋乏夏打盹) 的大作中提到: 】
: 2 hours digestion won't have star activity
: 【 在 genegene (白晶晶-二当家) 的大作中提到: 】
: : star activity?
: : using one enzyme each time could be better
: :
: : 【 在 batuloo (爱育栗拔力八达) 的大作中提到: 】
: : : 我要把一段基因clone到一个载体里面去
: : : 方法是用PCR引物将HindIII EcoRI位点引入PCR两头
: : : 然后粪房抽提 然后沉淀 然后双酶切2个小时
: : : 然后直接跑胶发现是smear
: : : PCR产物本来是很好的band
: : : 这smear到底是怎么回事
: : : 我相信水 buffer bsa 酶 都是好东东
: : : 大家可怜可怜我 帮我一把
: :
: :
:
:


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