发信人: biorad (biorad), 信区: Biology
标 题: Re: 求助 一个让我极其郁闷的问题
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Sat Sep 13 20:13:47 2003), 站内信件

按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，
0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，
pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度
（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）
16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳【 在 allice (羊儿乖乖) 的大作中提到: 】
: 在跑双向电泳前，你是用什末溶解你的样品的？这一步非常重要。 另外，你可以
: 用invitrogen 的silver staining kit, 大概1个小时就能出结果。
: good luck!
: 【 在 biorad (biorad) 的大作中提到: 】
: : 我的实验流程
: : 双响电泳（A 和B材料） 找到一个差异蛋白质 在A中有 而B中没表达
: : 测序 筛全长 构建原核表达载体表达 纯化 抗体制备
: : 现在 我反过去用我制备的抗体去验证 样品还是发现蛋白质差异的 A B样品
: : 同样跑双响电泳 转膜（附近的那一块胶） 结果A B居然无差异了
: : 在A中有4个点 （分子量都一样的 等电点不同） B中也有同样的4个点
: : (4个点到好解释 该蛋白的4个亚基或者是翻译后修饰的问题）
: : 预计A中有 B中没有的那个点 在B中同样也有
: : 郁闷坏了
: : 相关背景如下
: : 双向电泳中蛋白质的提取保存如下：
: : 秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPV
: : P-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙
: : 酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离
: : 心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小
: : 时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真
: : 空抽干
: : 此即为我提取的粗蛋白粉 保存于-20度 这个样品是2001年7月份提的
: : 当初 实验设计得不是很严谨 选用的A B 材料是这样的 A抗虫 B 感虫 当然A B之间还存
: : 在其它差异（性状）选用A B为亲本 构建了RI群体 里面选了一些极端株系 极抗 极感的
: : 因为当时做双向电泳很难找出差异表达的 而且我又不太喜欢那种表达差异不是很明显的
: : 有和无的差异 结果就比较可靠了 所以 看见这个有无的差异后 就高兴过了头 而且这
: : 个差异 在随机选出的 一个极抗单株 和一个极感单株里同样存在 差异蛋白质在这个极
: : 抗单株里有表达 而在选的那个极抗单株里 没有表达
: : 所以 接下来的工作就是测序了 到2002年7月左右才搞定
: : 用质朴测序 运气有点好 刚好把N端测了一段 中间测了一段 N端的结果表明 N端被乙酰
: : 化了
: : 现在出了这个问题后 真不知道是怎么回事 哎
: : 我想用 这两个样品 重新跑电泳 银染看看 是怎么回事 不过现在银染系统又出问题了
: : 又得换银染方法了 得摸一段时间了
: : 本来想利用这个抗体来 做该 蛋白表达谱分析的 看差异究竟是什么生理时期出现的
: : 虽然 该蛋白质的功能与什么蔗糖淀粉转换 细胞壁的生物合成等相关 但是我不得不去验
: : 证它出现这个差异 究竟代表着什么功能
: : 这样从蛋白质到功能真是难做啊 不知道各位有什么意见和建议？
: : 而且刚开始做 没任何直观经验 做了这么多的愈伤 （刚开始诱导后选的 大多都是非胚
: : 性愈伤组织 用的水稻材料是H1493 还不知道到时出不出苗呢 ）：
: : 而且 水稻的转基因好象有点复杂 有时即使转进去了 也发现不了什么表型上的变化
: : 就有点象石沉大海一样
: : 神啊 救救我吧 让我有个结果 能按时毕业吧 阿门！


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