发信人: nohate (无恨), 信区: Biology
标 题: Re: 谁有经验？ 关于dimerization 和 native gel
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Tue Apr 13 13:48:17 2004) WWW-POST


I used to make different constructs for 1 protein, they are all soluble, but
behave different, some are monomer, inactive, some are dimer inactive, some
are dimer active can't crystallize, some are dimer active can
crystallize......
And the difference between these constructs are just around 10 residues.

【 在 visa (有卡人士) 的大作中提到: 】
: I would like to suggest that whether it is dimer or not fully depends
: on condition, I have one protein mutant that when purified by nickle
: column,a2b2 complex is got, but run in native gel, dissociation is observed
: it is because of ionic strength difference between nickle column buffer
: and my native gel running buffer. as I know, when they are making crystal
: very extrem condition is used, so I would suggest you try a different
: condition which close to crystallization to see if there is dimer
:
: 【 在 littlecrab (小赖子乖乖) 的大作中提到: 】
: : E coli. 表达纯化的yeast蛋白不能形成二聚体 （GST pulldown), 但是crystal
: : stucture 显示有 dimer 的可能。那么也许某种yeast in vivo 的修饰是形成dimer
所不
: : 可缺少的, E. coli 则没有这种修饰。
: : 所以我致力于验证in vivo dimer. Co-IP worked. 但是是over-expression. 我需要
另一
: : 个approach 佐证。那位大哥有这方面经验呢。如果直接load　whole cell extracts
: : 于non-denaturing gel, 然后做western, 可行吗？
: : 如果先做IP, 有没有办法再跑native gel 呢？好像没法把目的蛋白从beads 上洗脱
而不
: : 破坏dimer 啊。
: : 还有别的什么建议吗。注意，in yeast, 即使是overexpression,
: : 也不可能看到coomassiee 染色的带的.
: : 千万帮帮我啊。我遇到别人提问，我答得上的都答的－－－不许到前面翻，我会的本
来就
: : 不多。
:
:

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请不要把我说成偶
请不要把我说成欧
请不要把车说成车车

精 ： 2220/ 2220 (100) 灵力： 3500 / 3500 ( 0)
气 ： 1580/ 1580 (100) 内力： 3780 / 3780 ( 1)

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