发信人: nohate (无恨), 信区: Biology
标 题: Re: 谁有经验？ 关于dimerization 和 native gel
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Wed Apr 14 08:37:58 2004) WWW-POST


可能我说的不太清楚，我解释一下，在表达一个蛋白质前，首先要做的是blast,
找到保守序列，然后设计constructs，比如我做的蛋白，保守序列是1500-2183，
那我这样设计construct,
N-terminal:1400,1409,1419,1429,1439,1449
C-terminal:2233,2223,2213,2203
这些加一起可以做24个constructs,我表达的结果1429-2233表达，很稳定，dimer,active
,crystallized,然后crystal structure表明在N-terminal和
C-terminal各有几十个残基disorder,然后我就在crystal structure基础上
再设计一些constructs,把disorder的残基cut掉，结果我又表达了几个
constructs,包括1476-2233,1476-2189,1495-2233,1495-2189等等。然后结果
就比较有趣了。
上面四个都表达可溶稳定，不同的是，1476-2233,1495-2233是dimer,active,
1476-2189,1495-2189是monomer,inactive。后来是实验表明1476-2233非常容易crystall
ize......
我想说的是，
1，设计construct的时候当然要cover保守区，所以没有visa说的问题。
2，除非表达的是full length，不同的construct可能会有不同的表现，N-或C-末端
（construct不会切到保守区，所以一般没有visa说的一个残基会改变很多的问题),
littlecrab的情况,根据你说的情况,crystal structure是dimer,你表达的是monomer,
1,有可能你的蛋白表达不同的construct表现不同,有的形成dimer,有的形成monomer,
2,也可能同样construct在不同buffer环境表现不同,
3,也可能是你自己说的原因,真核细胞和原核细胞的差别造成的.
如果你表达的construct和crystal structure的序列相同的话,可以排除1,否则你
需要表达和crystal structure相同的序列,然后看是不是dimer.

我觉得验证第3条原因很麻烦,我肯定要先排除前两个原因,然后再考虑第3个.
我做结构的,所以很多结构之外的东西也不太懂,这只是我的看法,说出来和大家
讨论:)
BTW,hooligan想知道这是什么蛋白干嘛?


【 在 littlecrab (小赖子乖乖) 的大作中提到: 】
: It is about 50KD.
: I saw good suggestions. Thanks, guys. Probably I will try to reproduce the
: condition used for crystalization. We did use the different constructs, too.

:
: Is it practical to run whold cell extract in native PAGE and then do western
: blot? Anybody did this before?
:
: 【 在 hooligan (月是故乡明) 的大作中提到: 】
: : What was this protein? Can you tell me the name?
: : Thanks!
: :
: : 【 在 nohate (无恨) 的大作中提到: 】
: : : I used to make different constructs for 1 protein, they are all soluble,
: but
: : : behave different, some are monomer, inactive, some are dimer inactive,
: some
: : : are dimer active can't crystallize, some are dimer active can
: : : crystallize......
: : : And the difference between these constructs are just around 10 residues.
: : : 【 在 visa (有卡人士) 的大作中提到: 】
: : : : I would like to suggest that whether it is dimer or not fully depends
: : : : on condition, I have one protein mutant that when purified by nickle
: : : : column,a2b2 complex is got, but run in native gel, dissociation is
: observed
: : : : it is because of ionic strength difference between nickle column
buffer
: : : : and my native gel running buffer. as I know, when they are making
: crystal
: : : : very extrem condition is used, so I would suggest you try a different
: : : : condition which close to crystallization to see if there is dimer
: : : 所不
: : : 另一
: : : 而不
: : : 来就
: :
: :
:
:


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请不要把我说成偶
请不要把我说成欧
请不要把车说成车车

精 ： 2220/ 2220 (100) 灵力： 3500 / 3500 ( 0)
气 ： 1580/ 1580 (100) 内力： 3780 / 3780 ( 1)

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