发信人: tianyu (tttt), 信区: Biology
标 题: Re: 谁有经验？ 关于dimerization 和 native gel
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Wed Apr 14 00:11:06 2004) WWW-POST

I wasn't talking about the crystal structure either.:)

I thought in the pulldown exp. you had a GST fusion to pull-down another
version of your protein, is that right? I am concerning about that your
GST-fusions are so geographically close to each other there will be very
little chance to form a GST-protein/protein dimer. Most of them will be
GST-protein/GST-protein dimer, that's why "E coli. 表达纯化的yeast蛋白不能形成
二聚体 （GST pulldown)".

But I'm just speculating, didn't know your exp. detail.

【 在 littlecrab (小赖子乖乖) 的大作中提到: 】
: I was misleading. The costruct for crystal is not the GST one.
: 【 在 tianyu (tttt) 的大作中提到: 】
: : your overexpression is a GST fusion? GST itself dimerizes.
: :
: : also, since you have a crystal structure showing the dimer potential,
maybe
: : you can do a mutation that abolishes the self association.
: :
: : 【 在 littlecrab (小赖子乖乖) 的大作中提到: 】
: : : E coli. 表达纯化的yeast蛋白不能形成二聚体 （GST pulldown), 但是crystal
: : : stucture 显示有 dimer 的可能。那么也许某种yeast in vivo
的修饰是形成dimer
: 所
: : 不
: : : 可缺少的, E. coli 则没有这种修饰。
: : :
: : : 所以我致力于验证in vivo dimer. Co-IP worked. 但是是over-expression. 我需
要
: 另
: : 一
: : : 个approach 佐证。那位大哥有这方面经验呢。如果直接load　whole cell
extracts
: : : 于non-denaturing gel, 然后做western, 可行吗？
: : :
: : : 如果先做IP, 有没有办法再跑native gel 呢？好像没法把目的蛋白从beads 上洗
脱
: 而
: : 不
: : : 破坏dimer 啊。
: : :
: : : 还有别的什么建议吗。注意，in yeast, 即使是overexpression,
: : : 也不可能看到coomassiee 染色的带的.
: : :
: : : 千万帮帮我啊。我遇到别人提问，我答得上的都答的－－－不许到前面翻，我会的
本
: 来
: : 就
: : : 不多。
: : :
: : :
: :
:
:

--

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