发信人: Cathleen (蛹-@-化蝶), 信区: Biology
标 题: Re: cloning strategy, asking for advices
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Sun May 23 23:47:34 2004) WWW-POST


【 在 lettuceiyv (fingernail) 的大作中提到: 】
: 你试过？是难以amplify 还是难以purify？
both for such short fragment ah.

: 你的建议很好， 但偶不想在5' 端加一段无关序列，而需要在引物5'加酶切位点再克隆
到
: 另一载体。

you can ligate the PCR product to TOPO first, then choose an enzyme close to
the upstream of ATG.

: 另一方法是直接合成两互补长单链（90-100bases），加热后自然冷却形成双链， 有人
这
: 么做过吗？

error rate is too high for synthesis of such a long oligo.

:
: 【 在 Cathleen (蛹-@-化蝶) 的大作中提到: 】
: : hard to amplify and purify 70bp, how about make it bigger? locate that
: primer
: : in the vector part.
: :
: : 【 在 lettuceiyv (fingernail) 的大作中提到: 】
: : : 谢谢， 还有个小问题。 第一个PCR产物小了点， 会有问题吗？比如回收纯化什么
的
: : :
: : : 【 在 Geneporter (Geneporter) 的大作中提到: 】
: : : : 你可以用4个鹦鹉做INTERNAL DELETION。注意其中的两个引物有重叠，做两PCR
后
: ，
: : 在
: : : 用
: : : : 这两次PCR混合做为第三次PCR的模板，再PCR即可。（三次PCR法做INTERNAL
: : DELETION
: : : ）
: : : : 。
: : : : 【 在 lettuceiyv (fingernail) 的大作中提到: 】
: : : : : 想用PCR做一个基因 (全长1.2kb)的deletion mutantion，
: : : : 需要delete的部分(约70bp)位
: : : : : 于该基因内部， 离5'ATG有70多bases。要求不改变阅读框， 请教该如何设计
引
: 物
: : ？
: : : 怎
: : : : 么
: : : : : 做比较高效省力，谢谢
: : : : :
: : : : :
: : : :
: : : :
: : :
: : :
: :
:
:

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闪亮的翅膀



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