发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: Re: 有没有人碰到过转质粒入BL21PlysS效率很低的情况？
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Mon Jun 14 19:49:13 2004), 站内信件


你这个问题我也碰到过。我是表达一个酶的一部分，用的是pET20b,
宿主菌柱是BL21(DE3). 表达出来的蛋白是包涵体，量很大，估计对细菌很
toxic.所以我transform BL21(DE3)的时候在板上硬是只长出了一个colony.
幸运的是可以表达蛋白。
所以你这个问题很正常，mutant之所以比wt更糟糕，也许是因为形成了包涵
体之类的东西。
我提不出什么更好的建议，只能建议你降低一下amp的浓度，说不定会有帮助。
pET系统的origin属于低拷贝，amp的浓度太高可能是菌落无法生长。
第二点比较麻烦一些。建议你先做一个阳性对照，扩增一个常见基因，证明
你的genomic DNA 没有问题。如果这个成功了，试一下touch down PCR好了。



【 在 ivytree (小pork) 的大作中提到: 】
: 我构建的蛋白表达质粒,pET3a 系统。原来做wt的时候就有这个问题。要用很大量的质粒
: 转化BL21 PlysS细胞才可能得到表达蛋白的克隆。但好歹我还是得到了。现在我做了几个
: mutant,根本得不到好的克隆。症状是细胞长的且小且慢，甚至不长。我克隆的基因来源
: 于M.tuberculosis.唯一我能想到的是对大肠杆菌细胞有毒性。但我不能解释为什么muta
: nt比wt还要糟糕的情况。另外想请教一般作heat shock的时候要多久？45s? 越来越觉得
: 自己手气不好。因为我实验室里说出去都没人相信。认为不make sense. btw:我质粒都是
: 测过序的。
: 另一个很霉的问题。我还在做一个从genomic DNA上pcr一段300bp多点的片断。也是搞不
: 出来。引物设计好像没有问题。引物Tm在60度左右。望有经验的前辈指点一二。//bow
: 最近实在很倒霉的说


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