发信人: smallbite (小咬), 信区: Biology
标 题: Re: 无法解释的结果，有点复杂，有空的同学请看
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Sun Jun 27 16:20:10 2004), 站内信件

哦，忘了提醒你一下
关于第三点，一般人们并不用target序列做probe，而要把probe选在target区域外
这是因为你的序列也可以randomly整合到genomic DNA中去，而你只想要homologous
recombinate的产物，所以不要用target序列做probe，否则有很多假的positve
Good luck!


【 在 lanceandfei (lance) 的大作中提到: 】
: 第一，我听说同源重组的话，你的target左右两臂长度应该不同，
: 一般来说是右臂是左臂的>2倍。
: 第二，我认为小鼠细胞并不需要NcoI enzyme才能去掉你的target, 可以再重组一把嘛。
: 第三，筛ES科隆的时候，为什么不用你的target序列做probe做Southern呢？
: 我正在做conditional KO的construct, 就是loxP的那个，也是第一次做，没有经验，不
: 知道想的对不对。
: 【 在 smallbite (小咬) 的大作中提到: 】
: : 辛苦了两年的project彻底失败了，遭受沉重打击，足有两三个月基本什么也没干
: : ，在实验室梦游。最近打起精神，开始仔细检查失败的原因，经过大量的测序工作
: : ，发现是因为发生了一个不可解释的奇怪现象，对此老板和我都毫无头绪，因此
: : post出来，诸位如果有闲有精力，请帮我看看，欢迎任何解释，建议。
: : 简单地说，我的project是要做一个transgenic的mouse，我想通过同源重组（
: : homologous recombination）的方法将一段序列插入到老鼠genomic DNA中去，我
: : 首先克隆了要插入的区域的DNA，然后用它来做target vector。我发现该段DNA中
: : 含有一个NcoI restriction site，序列是CCATGG，因此我就利用这个位点把DNA切
: : 开了，放入了我要插入的序列（长146 bp），这样我的target vector就含有两个
: : NcoI site，中间夹着146bp长的插入序列，这两个NcoI site的前面和后面分别是
: : 一段很长的(大约2.5kb)和genomic DNA sequence一样的序列，用来和genomic
: : DNA发生同源重组。如下图所示。
: : target vector：
: : ------*---CCATGG-->>>>>>>>>>>>>>>--CCATGG---**-------------
: : genomic sequence：
: : ------------------*---CCATGG---**--------------------------
: : 其中-->>>>>>>>>>>>>>>--表示我要插入的长146bp的序列。
: : 我transfect了embronic stem cell，southern blot的结果显示homologous
: : recombination十分成功，我的序列进去了（注：实际情况比我在这儿叙述的要复
: : 杂一点，这个southern blot结果并不能判断上面说的146bp的insert也进到
: : genomic DNA中去了），因此我接着做了blastocyst injection并得到了老鼠，接
: : 着灾难发生了，我怎么也得不到想要的结果，似乎那段146bp的序列丢掉了。后来
: : 我就开始了不断的测序，我确定，第一个NcoI site上游很近（只有21bp的距离）
: : 的一个位点（图中*所示）进去了，第二个NcoI site下游很近（只有22bp的距离）
: : 的另一个位点（图中**所示）也进去了，就是中间的那一段没进去，这实在是不可
: : 思议。老板和我都倾向于认为，homologou recombination本身没有问题，我的
: : insert 序列开始进到了genomic DNA里，但somehow细胞能够修复这段序列，它能
: : 辨认出此146bp是外源的，并用NcoI site把它切下，然后重新ligate。这样两个
: : NcoI重新变回一个，前后的序列都进去了，就是中间的丢掉了。
: : 可是这个解释很crazy，老鼠细胞怎么会有NcoI restriction enzyme呢？
: : 我实在是想不通....
: : 另：看起来这不是一个偶发事件，transfect ES cell后我一共筛选出了13
: : 个positive clone，取了其中6个继续实验，现在看来这6个全都丢失了两个NcoI
: : site中间的insert


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