发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: Re: 请同行帮助解决分子克隆问题
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Tue Oct 5 13:04:54 2004), 转信


对的。我一般是这样，不加insert,长一大堆菌落，加了insert菌落少了
很多，三分之一。但是随便挑几个做miniprep 和restriction digestion,都
有insert 出来。
两个引物的酶切位点旁边要有足够多的保护碱基，我至少用六个bp.这样
对PCR产物的酶切才能充分。另外，引物合成是从3'到5',到了5'端容易出现错误，
如果保护碱基够长，即使合成在5'端出现错误，也只是改变一下保护碱基序列
而已，酶切位点的序列还是正确的。


【 在 Ras (很颓的猪。) 的大作中提到: 】
: inserts will always inhibit vector self-ligation even if your desired
: ligation doesn't work.
: 【 在 BeatIt (菩提) 的大作中提到: 】
: : 现在在做分子克隆，帮到一个很奇怪的现象。我从酵母基因组中PCR出我的基因，看起来
: : 分子量还差不多，于是我就用引物上已经设计好的BamHI和SalI两个酶切，同样的方法处
: : 理载体，然后连接过夜，转化连接产物和载体自身的backbone做对照，现在得到的结果是
: : 我在backbone平板上得到一些克隆，大约150个（我用的是高效感受态细胞，转化后全部
: : 涂板），但在连接产物的平板上却没有任何东西，一样的平板和感受态细胞。非常奇怪的
: : 现象，我重复了一次但同样情况，有无同行遇到这样的问题，请给点建议，谢谢！


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