发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（三）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 17:44:52 2005) WWW-POST

本文献给YL

（三） 不溶的sigma32

　　 四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNA　polymerase。E.Coli RNA polymerase　核心酶是一个蛋白质复合体，只有合成RNA的活性，却没有
识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合，从而实现转录。我们这个实验
的核心主角就是其中一个因子，叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子。Sigma 32
过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任务就是要用变性
剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。
所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。我们先用1% Triton 来溶解细菌本身的一些蛋白，
inclusion body 相当稳定，不溶于triton,所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。
　下一步就是用变性剂来溶解inclusion body。用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N-十
二烷基肌氨酸钠）是一种比较强的阴离子去垢剂, 0.3%的浓度就可以让包涵体溶解。sarkosyl的优点是，
虽然在高浓度下有变性作用，低浓度下却对蛋白质有稳定的作用。所以用sarkosyl做重折叠之前的变性剂
是再好也不过的了。
　Burgess还要我们试了经典的 Gudn HCl（盐酸胍)来变性，作为对比。inclusion body 在这两种变性剂
下很容易就溶解了。然后我们得去掉变性剂，做重折叠。怎么做呢？方法有很多种，最简单的是透析，把
变性剂全部换掉。这个方法Burgess并不喜欢，因为，透析是个缓慢的过程。在透析袋里面，蛋白的浓度
还是很高。折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。另一种方法是突然稀释变性的蛋白，由于蛋白
浓度相对与透析低了很多，好一点。但是问题也是类似的。Burgess提议用逐步滴加稀释的办法。就是放
一大烧杯的缓冲液，里面有一个磁石可以不断混合液体，然后一滴一滴加入变性的蛋白溶液。由于烧杯里
的溶液蛋白量是逐渐增加的，所以一开始蛋白折叠中间产物能够相互作用的几率大大降低了。Burgess说的
还真象那么回事，可事实上，嘿嘿。我们先用试着重折叠Gudn HCl溶解的Sigma32。一开始还好，滴到
后来，溶液就变浑浊了，最后几乎成了冲淡了的牛奶那样的东东。Burgess脸色不好看，说不应该这样的。
我们一离心，沉淀出来一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清跑了一个Poros HQ 50阴离子交换柱，拿到的蛋
白很少，回收率小于5%。失败啊。
　从这里开始，我要岔开一下，讲一些跟这个模块实验没太大关系，但是很有意思的东西。　　


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