发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（五）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 17:57:06 2005) WWW-POST

本文献给YL

（五）"万金油"buffer
　 Dr. Burgess 这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国最早用
coomassie blue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述
一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写了一
封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。
　不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这
个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer, 可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他吹得神
乎其神，配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是这样的:

50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol　　

Tris EDTA NaCl 这三样都没什么，真正关键的是5%glycerol。有了这个glycerol, 很多蛋
白，尤其是酶会十分稳定。这个稳定的效果是十分惊人的。Dr.Burgess就此跟我们讲了他的
经历。六十年代的时候，他还是个小博士后，在watson 实验室里干，主要是纯化细菌RNA
polymerase的各个亚基。那时候一个大问题是RNA polymerase纯化出来后十分不稳定, 放冰
上, 过30分钟，活性还会损失一半。Burgess有一次不小心出了错误，把纯化出来的RNA
polymerase和glycerol 混合了。结果意外发现，RNA polymerase 变得十分十分的稳定。
稳定到什么程度呢,就是你把这个酶加上50%glycerol，用平信从美国寄十几天到澳洲，活性还
有7~80%！另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫键，加一点DTT，防止蛋白形成
非天然的二硫键, 也会对蛋白质的稳定有好处。
　为了让我们对这个 "万金油"buffer的好处有感性认识, Burgess设计了一个实验让我们做。
他之前已经准备好了在大肠杆菌中表达的GFP包涵体(inclusion body)。我们把包涵体分成两部
分，一部分用guanidinium hydrochloride（盐酸胍）溶解变性，另一部分用sarkosyl
(N-十二烷基肌氨酸钠）溶解变性。然后把这些溶解的GFP溶液分到一个96孔板上,每个孔10微升，
然后加入２０倍的refolding buffer 来稀释，稀释了之后，变性的GFP就开始重折叠。我们有一
个hampton 卖的refolding 试剂盒，内有十几种不同配方的refolding solution。我们试了所有这
些buffer 同时还试了TGE, TGE+15% glycerol, TGE+35% glycerol, TGE+45% glycerol,这四种
buffer。由于GFP折叠好了才能发荧光，用一个fluorescence plater reader，我们可以实时监控折
叠的效果。结果让人很吃惊，Hamton卖的这个试剂盒，虽然配方都很fancy,但是一塌糊涂，没有
一种溶液能让GFP重折叠的很好。相比之下，TGE的四种溶液都很好，GFP重折叠的效率是hampton
kit的几十倍。最强的是TGE+35% glycerol。
另外，不论是用Gudn HC变性还是用sarkosyl来变性，TGE+glycerol 的重折叠的效果都很好。
实验结果出来后，看着我们惊讶的表情，Burgess脸上都笑开花了，呵呵。这个实验我还学到的一
个教训是,不能迷信商业化的kit, 很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用。



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