发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（六）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 18:08:46 2005) WWW-POST

本文献给YL
（六）兴风作浪的乳糖(lactose)

　晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的，
但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌钟表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是
Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7 噬菌体，也是T7 RNA polymerase induction
system(pET 系列质粒)的发明者。
T7 系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个
系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被T7 RNA
polymerase 识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株,染色体里面已经整合入了由
LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase 基因片断。如果在细菌培养基里面加入
IPTG, 来诱导T7 RNA polymerase 的表达，就可以启动目的蛋白的表达。这个系统非常强大，原因
在于T7 RNA polymerase工作起来非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表达一个蛋白，表达量可以
占到大肠杆菌总蛋白量的50%! 大家可以想象，这种系统虽然很强大，但是表达量太大，对大肠杆菌有
毒性，造成的结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。
这一点我深有体会。我曾经想用细菌表达一个蛋白,而且估计这个蛋白会形成包涵体。妖怪的是，用质
粒转化蛋白表达菌株BL21(DE3)怎么也不能转化，铺的板一个菌落也没有。我当时就怀疑是因为表达的
蛋白对大肠杆菌有毒性，仅仅是本底的一点表达就足以杀死细菌。我来来回回一共转化了五六次，最后
终于找到了唯一的一个菌落。虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首，但是我没有仔细想过本底是怎么
来的。
这个问题到了bill studier做报告之后，才真相大白。原来我们一般用的LB broth有三种成分，其中一
种是tryptone. Tryptone是caseine的酶解产物，而casein又是milk里提取而来。由于milk 有乳
糖(lactose)，tryptone里面也有乳糖的污染。Bill studier研究发现即使很微量的lactose也能有效的诱
导蛋白表达。原来如此！！！
　所以要解决我原来的那个问题，用一种不含有乳糖的media做培养板就完事了。有意思的是，细菌有
一种很有意思的特点，如果培养基里有足量的glucose，细菌会优先摄取glucose,　而不能摄取lactose。
Bill studier　根据这个特点研究出一种可以自动诱导的培养基。这种培养基含有成比例的glucose 和
lactose。细菌首先摄取glucose，不摄取lactose,当细菌长到一定密度，耗完glucose之后，就开始摄取
lactose,从而开始诱导表达。所以用这种培养基养菌，很省事，接种了第二天收细菌，提蛋白就行了。
　最后Bill studier老爷子特别强调的是细菌的供氧。氧气是限制细菌生长最重要的瓶颈, 如果有足够氧
气在培养基里面, 大肠杆菌的密度可以从一般的OD600 2~3 翻十倍到20~30!　要提高培养瓶的供氧，
可以用baffled flask。这种flask的瓶底边缘有几处凹陷(类似于可乐塑料瓶底那样的形状)，能有效增加
空气的培养基的混合。
最后，详细内容可以见下列文献:
Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005)

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