发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（七）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 18:15:35 2005) WWW-POST


本文献给YL

（七）古怪的CDC6

　这里再给大家讲一个在大肠杆菌中表达蛋白质的例子，一个很夸张的例子，但是很有启发性。
　　Bruce Stillman 是冷泉港的现任主管，是一个绝对的牛人。不但科学做得很好，而且还很爱
国。他是澳洲人，在美国待了N年，却从没有加入美国国籍，所以他只是外籍院士。我们的晚间报
告有一个是他作的。他主要研究真核生物的DNA复制。这是一个到现在为止都没有完全弄明白的领
域。在报告里面，他特别提到了表达纯化CDC6蛋白的经历，我觉得十分有意思。这个蛋白, 用他
的话说，是"a pain in the ass"。
　CDC6是干什么的呢？这要从ORC说起。真核生物的DNA有多个复制起始位点(replication
origin)，ORC(Origin Replication Complex)是一个很大的蛋白复合体，可以识别这些复制起始位
点。ORC在整个细胞周期里面都是与DNA结合的。在G1期里面，CDC6这个蛋白会与ORC结合，同
时让MCM(DNA解旋酶)也装载到ORC上，形成一个pre-replication protein complex。这个complex
一旦形成，DNA 复制的准备工作就完成，只等其他kinase的激活，细胞从G1进入S期，复制就开始。
　Stillman 实验室一直想表达酵母的CDC6和ORC的重组蛋白，然后做结构研究。但是到了CDC6，他们
碰到了大麻烦。首先他们尝试真核系统来表达，但是意外的是，他们发现表达出来的CDC6完全没有活性。
然后他们尝试用大肠杆菌来表达。首先发现37度诱导表达出来的蛋白不溶，重折叠也没有用。然后他们尝
试在室温下诱导表达，发现蛋白虽然可溶了，但是都被降解了。然后呢，他们就想到了加一个GST tag,这
下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是还是没有活性。他们估计是因为GST可以形成dimer，干扰
CDC6的正常功能。所以呢，他们重新做了一个construct,在GST和CDC6序列中间加了一个蛋白酶切割位
点。正当他们满心欢喜的以为问题解决了的时候，意外又出现了。有GST的CDC6是可溶的，可是一旦把
GST切掉了，CDC就沉淀出来了....@#%#^&%$^#!!!
几乎是山穷水尽了，但是做这个project的博士后还是没有放弃希望，他做了最后的孤注一掷。他猜到
这个蛋白可能很不稳定，对缓冲液要求可能很高，所以他让一个本科生连续试了十多种buffer，最后发现
如果用磷酸钾＋谷氨酸钾缓冲液，切掉GST之后CDC6就不会沉淀了。Stillman认为谷氨酸根和磷酸根跟
氯离子相比更接近与核酸, 可能让CDC6更稳定。这个CDC6一共花了他们18个月时间, 却就这一点小trick!
这以后，他们表达的CDC6都有活性了，后来做了一系列的电镜三维结构重构实验，研究CDC6和ORC的
复合体结构。Stillman实验室正在准备一篇文章要投到nature上去。大家等着看把。


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