发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（八）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Fri Apr 29 11:14:36 2005) WWW-POST

本文献给YL

（八）”液体DEAE“

　绕了这么大一圈，现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们
试Gudn HCl溶解sigma32之后的重折叠，结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做
变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似，只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果
好了很多，至少没有浑浊现象了。接着我们用Poros HS 50，一种阳离子交换柱，
来把可溶的sigma 分离了出来。为什么这一次用Poros HS 50 而不是前面用的阴离
子交换柱呢？因为sarkosyl带负电，会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32
很奇怪，既有负电的表面，又有带正电的表面，所以可以用阳离子交换柱。值得一提
的是绝大部分蛋白质都是偏酸性，所以阴离子交换柱用的比阳离子交换柱频繁得多。
　　好了，聊完离子交换柱，现在回到Dr Burgess要我们作的另一个很重要的实验。
Sigma32在大肠杆菌过表达的时候，绝大部分都是inclusion body,但是也有一部分
是可溶的。这些可溶的sigma 32可以和细菌体内的Core RNA polymerase结合形
成复合体。我们这个实验就是要把这个复合体纯化出来。核心办法是用免疫亲合柱来
纯化。但是为了提高纯化的效果，Burgess要我们提前用PEI沉淀的办法来粗分一下。
PEI 是什么呢？就是polyethyleneimine （聚乙烯亚胺）。这个东东我过去没碰到，
所以很感兴趣。PEI呢是一个带正电的polymer，和酸性蛋白质和核酸结合以后聚合
体沉淀出来。由于这种结合是受离子强度影响的，感觉上很象DEAE那之类的性质，
所以Burgess称之为"液体DEAE"。RNA polymerase和DNA是结合的，所以PEI沉
淀DNA的同时，把RNA polymerase+sigma32都沉淀了下来。然后再用高盐洗脱
蛋白质，而DNA和PEI结合很紧密，所以还是在沉淀里面。这样一来，好多垃圾蛋白
和核酸都被去掉了。到了这一步，还有一个问题。就是洗脱下来的蛋白里面还有PEI,
如果现在就用透析的办法降低盐浓度，PEI和蛋白会重新形成沉淀。所以下一步就是
用硫酸胺沉淀的办法把蛋白和PEI分开。用低盐buffer重溶沉淀的蛋白,过免疫亲合柱
就行了。免疫亲合柱就没有什么好说的了。最后结果很不错，跑胶后用coomassie
blue 就可以清楚的看到RNA polymerase的各个亚基。


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