发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（九）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Sun May 1 22:44:00 2005) WWW-POST

本文献给YL

（九） 沉淀，沉淀，沉淀

　　上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉淀来去掉PEI(Polyethyleneimine）的步骤。
不常做生化的同学可能对硫酸氨沉淀的方法不熟悉。但其实这种沉淀是蛋白质纯化中
及其重要的一种方法。说实话我过去也很少接触，但是在这个课里面，四组实验中有
三个都用到了这个方法，可见其重要性。
硫酸氨沉淀是怎么做的呢？其实很简单，把磨细了的硫酸氨粉末往样品溶液里
倒就行了，蛋白就会相继沉淀下来。由于不同的蛋白，在不同的硫酸氨浓度下被分
别沉淀下来，这种方法把蛋白质样品粗粗的分离一下。这种方法对大量样品尤其好
用，因为比较方便快捷便宜。硫酸氨沉淀的优点是什么呢？最大的优点是这东西虽
然能让蛋白质沉淀下来，但是不会让蛋白质变性，所以沉淀下来的蛋白质一般可以
重新溶解。
　　其实沉淀蛋白质的方法有很多种，但是对于娇贵的蛋白质来说，很多常用方法
都太harsh了。我举两个例子把：TCA沉淀大家都熟悉的。TCA是个强酸，施放出
来的质子中和了蛋白质的负电荷，只留下正电荷与TCA形成不溶物，从而变性。
丙酮沉淀，通过改变介电常数来降低蛋白质的溶解度，从而沉淀，由于丙酮一类的
有机溶剂可以与蛋白质的疏水表面相互作用，所以沉淀的同时，蛋白质也会变性。
硫酸氨沉淀的机理是什么呢？简而言之就是盐析（salt out）。蛋白质在溶液里
面溶解度和盐浓度有关系。在低盐浓度下，如果增加盐浓度，会增强蛋白质的溶解，
这是因为，盐的离子与蛋白质表面的正负电荷配对，减少了蛋白质电荷表面相互作用
的机会。当盐浓度高到一定程度的时候，过多的盐会跟蛋白质疏水表面争夺水分子，
以至于蛋白质疏水表面倾向于相互作用形成聚合物沉淀下来。
　　硫酸氨如果运用的好可以帮很大的忙。Dr. Burgess讲过一个例子。他有一年去
一个公司做sabbatical。这个公司是做单抗的，有一个工序是要从ascites fluids 里
头把抗体给纯化出来。这个公司用硫酸氨沉淀的方法来粗分蛋白。Burgess很惊讶的发
现，这个公司竟然没有做仔细的分析，就随便用了一个很高的硫酸氨浓度，结果把抗
体和serum albumin一起沉淀了。但是其实可以用一个低一点的浓度，只把serum
albumin沉淀下来，从而把抗体和serum albumin分开。Serum albumin浓度是非常
高的了，这样一分，大大提高了后续纯化步骤的效率。
Dr. Burgess强调说，用什么浓度把什么蛋白沉淀下来，完全是经验性的，而且每
次都不一定能重复的。因为是否能沉淀下来跟蛋白质浓度有关系，而每次样品内目标
蛋白的浓度不一定一样。有一个很简单的方法可以用来估计蛋白质沉淀所需硫酸氨的
浓度。把样品分成五份，每份分别加硫酸氨至20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 离心去掉沉
淀，保留上清，再向上清里面添加硫酸氨使浓度从20%到30%, 30%到40%, 40%到50%,
50%到60%, 60%到70%，离心保留沉淀，然后分析沉淀里的蛋白, 看看目标蛋白到底在
哪里，就完事了。


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