发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Wed May 11 20:43:26 2005) WWW-POST

本文献给YL


（十） 永远的转录因子
　　　
　 第一个模块的实验结束以后，我们进入第二个模块的实验。这个实验的指导教授叫Al Courey。
这个模块的实验主要是要从Hela细胞里纯化AP-1。AP-1是一种很重要的sequence specific转录因
子，在很多生理过程里都有作用。AP-1其实不是一种均一的蛋白质，实际上一种二聚体结构，要么
是Jun-Jun 或者是Jun-Fos dimer。Jun和Fos都是alpha helix的结构。Helix的一边有很多Leu,和
另一个helix形成Leucine Zipper的结构，而helix另一边就是碱性的氨基酸居多，所以可以和DNA
结合。这个转录因子看起来就象一双筷子夹着DNA。
　 sequence specific转录因子是极其重要的一类蛋白质，真核生物的基因有5~10%是用来编码
这种蛋白的。这个模块涉及的一些实验是最经典的一些分离转录因子的方法，所以很有用。
　 怎么才能分离纯化呢？首先要确定要纯化什么因子，换句话说就是要决定纯化跟什么特异DNA
序列相结合的转录因子。决定了这个，才能有一个活性检测系统，才能真正开始纯化。另外就是，
可以把这种特异序列的DNA固定在柱子上，然后做亲合层析，纯化效率会非常高。
　 整个纯化过程是这样的：首先制备Hela细胞的核提取物，然后用硫酸氨沉淀的办法粗分一下组分，
小分子量蛋白(比如Histone H1) 因为无法沉淀而被去掉。到这里比活力会增加到原来的2倍。然后粗
分的产物再跑一下凝胶过滤层析，比活力再提高到初始产物的5到10倍。凝胶过滤的产物再过DNA
affinity column, 比活力从5-10倍一下子提到了50~100倍。到了这一步，AP-1可以占到蛋白量的
10~50%。
值得一提的是这个凝胶过滤层析。我们用的是Sephacryl S-300 HR 凝胶(一种聚
丙烯酰胺凝胶)，这种凝胶分辨范围大概是10KDa到几千KDa，但是这种凝胶是比较粗的一种介质，
分辨率不能跟superdex之类的比。大概由于不是那么精细，所以可以自己手工装柱，我们用的柱
子是Amersham的XK26/40(直径2.6cm, 高度40cm）。装好的柱子分辨率真的是很低，AP-1的洗
脱体积跟空体积(void volume）相差挺小，而AP-1只有40~50KD已经很小了。这样一来很多蛋白
根本没可能和AP-1分开！这也就是为什么这一步纯化倍数很小的原因。这样一来，为什么要自找麻
烦做这又贵又麻烦的一步呢？原因在于这一步可以去掉核提取物里面的核酸酶，所以如果直接跑
DNA affinity column, column上的DNA Oligos会被降解掉！另外一个原因是，核提取物有一些
可以和DNA非特异结合的蛋白，这些蛋白会饱和DNA affinity column，影响要转录因子的纯化。
这个纯化步骤说明，不同的纯化手段必须加以精心组合才会有最好的效果。

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