发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十一）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Mon May 16 14:19:57 2005) WWW-POST


　本文献给YL

（十一）核抽提物

上回谈到纯化AP-1转录因子的大致流程。其实在过柱子之前的核抽提物的准备
也是十分关键的。从天然产物中纯化蛋白，如果大概知道蛋白在什么细胞器官，把
细胞器先分离出来作为纯化的起始原料，可以省好多事情。因为细胞器官的分离的
方法已经很成熟了。
　　核抽提物是怎么准备的呢？首先，融解Hela细胞。我们在这个模块用的细胞都不
是自己长的，而是直接从一个公司Biovest 买来的。据说这个公司有NIH的补贴，
所以价钱不贵。一升media的Hela细胞才要１７刀。冻存在-80度的hela泡在有
glycerol的buffer里面，第一件事情就是要用有镁离子的PBS来冲洗几遍。然后用
一种低渗buffer来重悬细胞。这种低渗buffer盐浓度很低，所以由于渗透压的影响，
hela细胞膜会变得比较脆弱。这个时候呢，把重悬的细胞用Dounce 匀浆器处理一
下,把细胞膜弄破。低渗buffer里头虽然盐浓度很低，但也不是没有盐在里面。主要
有两种成分，一个是10mM KCl ,另一个是 1.5mM MgCl2。KCl没有什么好说的，
可以换成NaCl。MgCl2 就关键多了。镁离子可以稳定细胞核, 让细胞核不至于在破
碎细胞的时候就破裂。当然说是这么说，一些转录因子还是可能在匀浆的过程就漏出
来。细胞膜破碎之后，细胞核还是基本完整的，细胞质里面ER , Golgi之类的东东都
漏出来了。然后再来一个低速离心。细胞核是比较重的，所以一离心，马上就沉淀下
来了。而其他细胞质或者细胞膜的成分比较轻一些，还留在上清里面。
　　现在想起来，细胞器官的分离，几乎无一例外都是利用细胞器比重不一样来分离
的。细胞核是最好分离的了，因为比其他的膜结构重得多。有些细胞器，比如要把Golgi
和ER分开，是个十分麻烦的事情，因为比重相差太小了。有些时候，可以用一些古怪的
办法来分离。比如lysosome把，比重和线粒体及过氧化酶体很相近。一种办法就是往一
堆无辜的耗子注射一种特殊的去垢剂叫Triton WR1339。耗子根本不能分解吸收这种化合
物，就积累在肝脏细胞的lysosome里面，使得lysosome比重变轻了一些，这样就可以把
lysosome从mitonchondria和peroxysome分出来了。话扯远了，现在再回到AP-1purification。
　　细胞核虽然被沉淀下来了，但里面还有很多染色质,　如果DNA都降解漏出来，麻烦就大了。
所以下一步就是用高盐buffer(0.42M KCl)来破碎细胞核。核膜，染色质之类的垃圾不能溶解，
转录因子之类的蛋白却能溶解。再一离心，取上清就行了。我们要的转炉因子就在这里面。按理
说，到这一步就可以上柱子了，但是这种上清溶液里面还有不少histone H1，可以抑制体外转
录反应。为了祛除hisone, 我们又做了一步硫酸氨沉淀，histone由于太小，沉淀不下来，而转
录因子什么的都可以被沉淀下来。沉淀重悬一下就可以跑Sephacryl S-300 的柱子了。　　

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