发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十二）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Tue May 17 20:02:58 2005) WWW-POST

　本文献给YL

（十二）Gel filtration的先天缺陷

　　　上一篇讲到核提取物。实验的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。
这一步实验是整个课程中第一次跑凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography)，
我感觉还是很激动的。Gel filtration 是色谱中及其重要的一个种类。我先来谈谈
原理把。Gel filtration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。这些微珠呢，并不是
实心的，而是有很多孔状结构。当蛋白质样品经过这些微珠的时候，如果蛋白质分
子体积太大，不能通过微珠的孔状结构，就会绕过微珠，很快的被洗脱下来。如果
蛋白质分子体积不是那么大，可以通过微珠的孔状结构，就会迟一些被洗脱下来。
这样，蛋白质分子可以根据大小而被gel filtration column分开。
Gel filtration 和其他色谱方法一个显著的不同是：Gel filtration 并不依赖
蛋白质分子与柱材料的结合来分离蛋白。这个特点的一个好处是，所有的蛋白样品
最后都能被洗脱下来，柱子重复用也不会有什么问题。但是这个特点也给Gel filtration
带来了一个严重的缺陷：低分辨率。分辨率包括两个因素，一个是两个蛋白峰的距离，
另一个是，蛋白峰的宽度。由于蛋白在gel filtration column里面并不与柱材料相互结合，
所以很容易扩散(diffusion)，扩散的结果就是蛋白峰非常宽。这个宽度非常要命，很多
时候即使用了很好的柱子，蛋白顶峰也大致能分开, 但是由于蛋白峰太宽，重叠在一起，
这样就很难分干净。另外，两个不同大小蛋白的洗脱体积的差别与分子量差别的对数呈
线性关系，所以可以想见，如果分子量相近（比如只差两三倍）的话，洗脱位置也会相
近，Gel filtration是很难把两个蛋白完全分开的。
　　 说一件我的糗事。有一次一个师妹遇到了一个难题，表达一个GST-tagged的蛋白
有一个降解产物。她想要的蛋白50kD,而那个降解的产物有30KD。她问我该怎么分开。
我没仔细想，就告诉她用Gel filtration。现在想起来，这实在是个昏招。当然，欣慰的
是，该师妹最终没有试gel filtration, 用别的方法解决了这个问题。:-)　
如果要想蛋白峰宽度变窄一点，怎么办呢？就样品而言，体积越小越好，理想状况是
小于柱体积的２％。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，这样空体积就
会小一些，扩散就不会那么严重。另外柱子里的微珠大小均匀一些也会有帮助。这种改进
带来的一个问题就是，需要用FPLC之类的设备提供较高的压力, 柱子才跑得动。另外分辨
率好的柱子往往不能手工装，得买预装的柱子，这样就很贵（很贵很贵！！！）。
　　唠叨了一大堆，我想表达的一个中心意思就是：如果你想从一个蛋白质混合物很干
净的把一个蛋白纯化出来，Gel filtration是肯定没戏的。
虽然gel filtration 不能很精细的纯化蛋白，但是它还有另两个非常重要的用途。一
个是脱盐，另一个是确定蛋白大小。这两个用途是其他种类的色谱没法作到的。



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