发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十四）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Fri May 27 18:25:41 2005) WWW-POST


　本文献给YL

　（十四）anfinsen的疑虑
　
　　跑完sephacryl柱子，组分就可以过DNA affinity column。DNA affinity column虽然很重
要，但是这一步技术上来说要求很低。买来CNBR活化好的agarose，然后让特定序列的寡聚核
苷酸固定上去就行了，柱子也是最简单便宜的一次性柱子。
　 亲合层析是目前最常用也最强大的一种蛋白质纯化技术, 纯化效率比别的层析方法可以高出一
两个数量级。这种方法诞生是六十年代的事情。当时是在NIH的Anfinsen实验室。Anfinsen是一
个诺贝尔奖获得者，可以说是蛋白质折叠研究的老祖宗。他主要贡献是通过研究ribonuclease 的
变性和重折叠证明氨基酸序列就可以决定蛋白质最后的三维结构。他实验室那时侯有一个学生一
个project是从葡萄球菌里面提取大量核酸酶，然后研究enzyme-inhibitor interaction。这个纯
化可是很麻烦的事情，用gel filtration, ion-exchange, hydrophobic interaction,　效率都很
低。有人可能会问，怎么不在E.Coli表达his-tag重组蛋白，然后用Ni-beads纯化啊？答案很简
单，那个时候根本没有molecular cloning 这些技术，也没有Ni-beads这些东西，Ni-beads也
是亲合层析的一种，是好多年以后才发明的。这个学生有一天突发奇想，既然inhibitor可以与
enzyme结合，为什么不能把inhibitor 固定在beads上面，然后用来纯化蛋白呢？后来他试了
一把，结果非常成功。搞笑的是，anfinsen自己很怀疑这个技术是否能work, 勉强答应把自己名
字署在在那个学生的文章，还强调如果没有别人能重复，自己心就是悬着的。呵呵。从此以后，
各种各样的亲合层析层出不穷，成为生物实验室蛋白质纯化的最主要工具。
　　八卦完历史，现在介绍一下亲合层析的种类。通用的亲合层析包括IMAC(Immobilized
Metal Affinity Chromatography)和IAC(Immunological Affinity Chromatography)。这些东东
大家应该都熟，类似于Ni-beads, proteinA beads之类的东西，几乎所有人都会用到。需要动点
脑筋的是一些利用特定蛋白质特定性质的亲合层析。比如我们实验室研究的糖基转移酶把，有两个
反应底物，一个是nucleotide-sugar,另一个是一个小蛋白质 EGF-repeats。由于这个酶与两个底
物都有结合，所以可以把这两种底物分别结合在beads上，然后跑两次亲合层析。AP-1的纯化呢，
则是利用了转录因子与DNA序列的特异结合。所以呢，在做亲合层析之前，一定要根据蛋白质本
身的特点来选择相应的ligand。决定了ligand之后呢，就得考虑怎么把ligand偶连在beads上了。
CNBr活化是最常用的一个方法。原理很简单，CNBr的碳对beads上的羟基发起亲电进攻，产生
一种叫cyclic imido carbonate的中间产物, 蛋白质或者核酸的伯胺基团(primary amine , -NH2)
与其发生反应，形成共价键联在beads上。蛋白质的primary amine主要来自于lysine, 如果要偶连
的蛋白没有lysine用这种偶连方法就不好。DNA的primary amine来自于AGC三种碱基。DNA是双
链互补的结构，碱基上的primary amine都要形成氢键。所以呢，要想把DNA oligo固定好，必须
得有不配对的overhang才行。这是一个小窍门，但是给我们的一个启示是，要做好affinity resin,
了解一些基本的偶连方法的化学原理是很有用的。 　



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