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发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十五）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Mon May 30 01:10:07 2005) WWW-POST
本文献给YL
（十五）AP1的活性测定
第二个模块的实验，DNA affinity chromatography之后我们又跑了一个更精细的
Gel filtration，用的是Amersham卖的Superose 6预装柱子。纯化步骤就只有这么多了。
剩下的就是一些活性测定。无论是sephacryl分出来的组分还是DNA affinity column分出
来的组分，我们都测试了AP-1的活性。方法呢就只有两种，一种是凝胶迁移率变动分析
(EMSA)，另一种是DNA水解酶I 足迹分析 (DNase I footprinting assay)，都可以用来分析
蛋白与特定DNA的结合能力。我过去没做过这两种实验，所以感觉很新奇，做的也格外卖
力，结果也还不错。
Gel Mobility-shift assay 原理很简单，把蛋白质样品和P32标记的寡聚核苷酸探针
一起孵育十几分钟, 然后拿去跑一个低浓度acrylamide胶。如果探针结合上蛋白了，速度
会变慢很多，就会停滞在胶的上段；如果没有结合上，探针就会自由的跑到胶的下段去。
然后把胶拿去做放射自显影就行了。跑胶的装置块头挺大的，是用来跑DNA测序胶的装
置。把两大块玻璃板和两片spacer夹起来之后, instructor先做一个gel plug，就是配少
量gel溶液，然后加过量的TEMED，然后迅速加到玻璃板中间，这些胶还没漏完就会凝
固，所以会封住底端。这是一个小窍门，据instructor 讲，这个方法虽然很粗糙，但是比
其他任何封底的办法都管用。还有一个小窍门。是这样的，由于胶的浓度低，比较脆弱，
另外尺寸比较大。跑完如果把一块玻璃板从胶上拿开的话，胶的某些部分会分别粘在两个
玻璃板上，这样取胶的时候就很容易把整个胶弄破。我们做胶的时候，指导老师要我们把
一块玻璃板的贴着胶的一面硅化（用sigmacote, 成分是氯化有机硅氧烷) 一下，使得这一
面比较疏水，就不会与胶粘在一起了。这样打开胶夹层的时候,胶只会紧紧贴在一面玻璃上
面，把胶和这整块玻璃拿去放射自显影就行了。生物实验要想令人心服口服，没有对照是
不行的。EMSA也不例外。阳性对照很简单，是看看系统能不能work。关键是阴性对照，
来看蛋白质与探针的结合是否特异。EMSA的阴性对照有两种，一种呢，是用来看和探针
的结合的蛋白是不是特异的某一种蛋白。做法很简单，就是蛋白质和探针孵育的同时加入
抗那种蛋白的抗体，抗体识别蛋白质之后会形成更大的protein complex, 在胶看起来就
是探针的迁移率进一步降低了。这叫"supershift"。另一种对照呢，是看蛋白质与探针的结
合是不是与探针序列有关，因为如果是非特异性的结合，纯化就没有意义了。这种对照也
很简单，在蛋白质与探针孵育的同时，加入没有同位素标记的探针来竞争。如果加入完全
同序列的竞争DNA可以削弱protein-DNA interaction，一两个nucleotide不一样就无法
削弱的话，说明看到的探针与蛋白质的结合是跟探针序列紧密相关的。我们在实验中用了
第二种control, 效果挺惊人，仅仅是两个nucleotide和探针不一样，竞争DNA探针就没
法work了。
Gel Mobility-shift assay虽然能够证明一段Oligos是否能和蛋白质结合，却还是不
能告诉我们该蛋白质到底与哪一小段的序列直接接触。DNAase I footprinting assay 正是
用来解决这个问题的。DNase I 可以随机的分解DNA，正常情况下，一段DNA探针各处被
酶切的可能性大致相当，如果跑胶再做放射自显影的话，看到的会是DNA ladder一样的
东西。但是，如果有蛋白与特定区域相结合，DNase I无法酶切那一部分，我们看到的
ladder 就会空缺一部分。这样我们可以知道那一部分没有被切到。这个实验步骤其实不复
杂，但是有些tricky，实验的关键是DNase I 的用量和酶切时间。首先是做同位素标记探针
的stock solution。stock solution里面除了探针以外，还加了非特异DNA,类似于poly(dI-dC)
poly(dA-dT)之类的东西。有一种成分引起了我的注意，聚乙烯醇(poly-vinyl alcohol)。
这东东比较粘稠，为什么要加它呢？大家想想看，用来做DNAase I footprinting assay 的
样品都是通过跑柱子的fractions，转录因子必定是被稀释得很厉害的。足迹实验最关键的
就是要保证样品蛋白和探针有充分的结合。聚乙烯醇性质就象一个"分子海绵"，占溶液体积
不说，还跟蛋白质抢夺水分子，所以加入这个东东之后呢，蛋白质和探针的有效浓度都增大
了，这样有利于蛋白质和探针的相互结合。聚乙烯醇的作用原理跟PEG很相似，第三个模
块的实验里面会用到PEG沉淀。探针stock solution配好之后，就是加我们纯化出来的组
分，孵育十几分钟。之后呢就是做DNAse I 酶切。我们这一组里，我和丹麦女生负责做酶
切，这个酶切可是把我们忙坏了。为什么呢？酶切一共有三步，间隔时间很短。第一步是
加Ca2+和Mg2+孵育一分钟, 第二步是加DNase I 孵育一分钟, 第三步是加反应中止液。
我们是三个三个一做, 每20秒加一个样品, 这样三分钟三个样品都完成了。丹麦女孩计时，
然后我加样品。可能是太紧张了把，我们连犯了两次错误，漏加了Ca/Mg，只得重做几个
样品。最后看结果的时候，我还特紧张，因为这是很重要的一份试验数据，最后结果很不
错，还受了老师表扬，呵呵。
好了，第二模块的实验，到这里就差不多了。这个培训课两星期的课程也进行了一
半。全体成员放假一天休息，而放假前一天晚上也没有报告。我学校离CSH很近，索性晚
上就溜回去了，顺便还把好友YL硬拉出来听我汇报学习心得，呵呵。
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