发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十六）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Mon May 30 22:27:57 2005) WWW-POST


　　本文献给YL

（十六）浮起来的细胞膜

　　休息了一整天，晚上全体学员和老师去一家sushi店饱餐了一顿生鱼片。第二天
早上，第三个模块的实验开始了。老师是Sue-Hwa Lin，这一个模块是从大鼠肝脏里
面提取胰岛素受体并且做一些鉴定。四个模块的实验之中，我最喜欢这个模块。主要
是因为这是唯一一个设计膜蛋白纯化的实验，而膜蛋白纯化是所有蛋白质纯化中最麻
烦的一类。受体蛋白纯化尤其麻烦，往往可能找不到又快又准确的测活办法。胰岛素
受体即使溶解在去垢剂里面也能与胰岛素接合，所以用简单的binding assay就可以
测活了。相比之下有些受体就不那么好伺侯了，比如我研究的Notch受体，配体也是
膜蛋白，Notch和配体必须都簇集在细胞表面或者固体表面才能有接合，溶液中的游
离状态下根本没法相互作用。
　　Sue-Hwa Lin是一个好老师，喜欢在做实验之前详细给我们讲解背景知识，这一
点上她比其他三位老师都做得好。另外她的助手是一位台湾的中年妇女，在Sue-Hwa
实验室做research assistant professor。这位助手特别nice，给我帮助很大。
　　好了，现在聊一聊纯化的实验步骤。首先是把大鼠肝脏的质膜部分分离出来，然
后呢用去垢剂溶解一下，用凝集素层析来粗分一下组分，然后做受体测活与鉴定。大
家可能注意到，最后纯化出来的受体只是粗产品。事实上，手册上这个实验里面还得
做一步insulin affinity chromatography来精制一下的。但是最近好多年，很多学员
更希望做一些重组蛋白纯化的实验，所以就把原来的实验给切短了。我觉得这种做法
很不明智，因为重组蛋白纯化的实验实在不需要花几千刀来冷泉港学的。
　　细胞膜结构的分离是一门大学问，著名的Methods in Enzymology有专门的一辑
整本都是讲这个的。细胞膜结构主要有核膜，质膜，线粒体，内质网，高尔基体，溶
酶体等等。其中核膜是最容易的，因为细胞核很重，稍微离心一下，就沉淀下来了。
其它的膜结构中呢，线粒体是最重的，质膜由于有胆固醇成分，所以是最轻的。这两
种膜结构也是很好分开的。剩下的膜结构比重比较相似，所以不好分。
　　膜结构分离的方法呢，有很多种，但是变来变去，无非都是两种基本方法的组合：
差速离心+蔗糖梯度离心。差速离心（differential centrifugation）是粗分膜结构的
一种常用方法。其实很简单，就是用不同的速度离心三次。首先用等渗缓冲夜来做组织
的匀浆，然后就开始离心。第一次是低速离心，只用600g，这么小的离心力下，只有
未破的细胞和细胞核才会沉淀下来。细胞主要的膜结构以及细胞质都还在上清里面。
拿上清再做第二次离心，这回离心力大了一个数量级，到了8000g。由于线粒体比其
它膜结构要重一些，所以线粒体沉淀下来，而其它膜结构还在上清里面。去上清进行
第三次离心，这回离心力比前一次又要大一个数量级到了十万g。所有的膜结构都会在
此时沉淀下来，所以也包括质膜。需要强调的是，差速离心的分离是非常粗糙的，并不
是十分干净。下一步的蔗糖梯度离心就要精细得多。但不管是什么分离方法，本质上
都不完美，千万不要指望从某篇文章找到一个方法就能套用。最好的办法是利用细胞
膜结构特征性的一些标记物（比如plasma membrane, 测5' nucleotidase　的活性)
来分析分离方法的好坏，并加以改进。
　　我们分离质膜用的方法稍微特殊一点，省掉了差速离心这一步。这种方法对于分离
大鼠肝脏质膜比较管用，对别的组织就不一定好用了。我们一组四个人，每人都分了一
个新鲜冰冻的大鼠肝脏（解冻后很难闻），然后就是拿刀片剁啊剁。弄碎了之后就加一
种低渗缓冲液，再把碎的肝脏和缓冲液倒到Dounce匀浆器里面做匀浆。匀浆用的缓冲
液里面加有Ca2+，比较重要。钙离子能够促进质膜碎片的聚集，这样在1500g这样小
的离心力下，质膜也能被沉淀下来。我们把匀浆用两层cheese cloth过滤，去掉了很多
结缔组织。然后就是用1500g离心了。拿出离心管一看，果然有一个很松的pellet，包括
了质膜，细胞核之类的东西。然后再把pellet转移到Dounce匀浆器再弄均匀了。下面
就开始准备蔗糖梯度离心(sucrose gradient)。蔗糖梯度离心是十分古老的一种方法，
但直到现在还有很广泛的应用。我们首先往pellet 匀浆里面加69%的蔗糖溶液，一直到
终浓度变为44%为止。蔗糖的浓度十分的重要，如果不准的话，根本就没法分开。我们
有一个折射仪，可以很快的测出溶液的折射率以及对应的蔗糖浓度。这个折射仪看起来
很粗糙，但是却十分好用。下一步呢，就是把加了蔗糖的匀浆转移到超速离心管里，然
后在上层铺一层42.3%的蔗糖溶液，接着就是超速离心两小时（九万g）。前面提到过，
质膜相比其他膜结构而言是比较轻的，所以呢，在离心的过程中就会浮到上层来。我们
吃罢午饭，就回来看离心管，果然看到一层棕色的东西浮在最上面。这层质膜看起来有
点像果冻，可以用小勺舀出来。到这里质膜的分离就算完成了。　　　　　


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