发信人: Cajal (chump), 信区: Biology
标 题: Re: 请教nuclear extraction
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Jun 9 19:49:28 2005) WWW-POST

我相信DNA已经流出来了，也就是说核膜已经严重破坏了。验证很简单，取一滴放
在细胞培养用的10X倒置显微镜下看看是否还有成形的细胞核。
用低渗溶液加Dounce Homogenizer (Dignam et al)制备的核在显微镜下是很干净的
球状，用Streptolysin-O (SLO)或者digitonin制备的可能会看到残留的细胞膜在外
面。你的方法大概类似Pierce提供的NE-PER nuclear extraction kit，得到的其实
已经不是严格意义上的核抽提液了，得到的蛋白浓度要比Dignam的方法低很多，一些
要求较低的实验里可以用，但很多实验比如RNA剪接实验，你的方法估计不行。不妨
目前先继续做下去再说。

【 在 wisteria (枕头) 的大作中提到: 】
: 我用hypotonic-low salt-high salt的系统extract nuclear protein。 hypotonic
: buffer 冰上10－15分钟后，大部分细胞已被lyse，溶液粘稠，有粘稠的团(絮?)生成。
这
: 是表示细胞膜裂解了呢，还是表示nuclei膜也破了以至于粘稠的chromatin析出? 正常
情
: 况下，intact nuclei的pellet是粘稠的么?
:
: hypotonic 之后加些许detergent，然后spin
: down，得到的就是上述的粘稠pellte，用low salt buffer
: resuspend，很粘，基本很难resuspend，顶多是用弄成絮状。加high salt以后就更不
用
: 说了。最后提取到的nuclear extract，蛋白浓度有4－5mg/ml.
:
: 感觉这个粘粘的东西很麻烦。哪位有经验的大侠可以指点一下，正常应该是怎么样的?
:
: 非常感谢!
:
:

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