发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十七）
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 27 11:21:31 2005)

本文献给YL

（十七）何去何从

　上一章提到从大鼠肝脏提取质膜的方法。质膜准备好了，下一步就得考虑
怎么溶解质膜。最主要的问题是：用什么去垢剂呢？Dr.Lin在这一步试验里面
要求每一组中的四个人各选一种去垢剂来溶解质膜，纯化完之后再比较不同去
垢剂的蛋白质纯化效率，看看哪一种去垢剂最有效。选择去垢剂很简单，无非
是想让膜蛋白能被充分的溶解解离下来，同时又不使蛋白变性。事实上，纯化
膜蛋白时去垢剂的选择是没有规律可循，除了一些显而易见的不适和做纯化的
去垢剂(比如SDS)外，很难讲什么去垢剂好什么去垢剂不好。所以，只能具体
问题具体分析，一个一个去尝试。我们这一组人选的四种去垢剂分别是:
Triton X-100, Sodium Cholate, Chaps, 和Octyl glucoside。我选的是
Octyl Glucoside。

　　好了，我先来讲讲去垢剂的小常识。去垢剂其实是很大一门学问，我几年
前就花过好多力气来学习其中的一些知识，但到现在为止还是只懂了一些皮毛。
这里就权当抛砖引玉了。首先，什么是去垢剂(detergent)呢？就是同时具有
疏水和亲水两种基团的化合物。虽然脂类化合物也有类似性质，但是去垢剂能
够形成胶束(micelle)，所以相比之下非常易于在水中溶解。去垢剂的疏水基
团一般是下面三种(1)直链或者支链烷基结构(2)类固醇之类的多元环结构(3)取
代苯基结构(比如大家常用的Triton X-100或者NP-40)。去垢剂的亲水基团一
般有(1)羧酸基团，比如胆酸钠(sodium cholate) (2)两性离子基团, 比如CHAPS
(3)糖类衍生物,比如Octyl glucoside, (4)聚乙氧乙醇基团, 比如Triton X-100
和NP-40。Triton X-100和NP-40大家都用得比较多。它们实际上是同一种去
垢剂，疏水基团是取代苯基，而亲水基团是聚乙氧乙醇基团。我想强调的一点
是，聚乙氧乙醇基团与氧气很容易发生反应形成过氧化物, 如果用在蛋白质纯化
里面，很有可能会破坏蛋白质的活性。所以一般商业化的,比较纯的NP-40和
Triton X-100都是小包装，而且在包装瓶子里面充有惰性气体。

选择适当去垢剂来纯化膜蛋白，有一些实际问题必须先想好。我强烈建议
大家以后选择和使用去垢剂的时候先考虑以下几个问题：

　　(1)选择的去垢剂是否干扰蛋白质浓度的测定？
类似于Triton X-100之类的去垢剂有苯环结构，所以在280nm有很强
的吸收。而相比之下CHAPS和胆酸钠之类的去垢剂就没有这个问题。另外，有
些去垢剂会严重的干扰一些protein assay。比如常用的Bradford assay，用的
是commassie blue G-250染料。这种染料在酸性条件下呈现为褐色胶体物质，
但在与疏水物质结合之后会变得稳定而呈现蓝色。所以可以想见，这种染料不
单能染蛋白质，也能染一些去垢剂。我们在实验一开始专门做了测试，发现
Triton X-100和sodium cholate对Bradford assay 干扰比较严重，chaps,
尤其是Octyl glucoside基本上没有什么干扰。遇到这种干扰问题，要么换去
垢剂，要么换protein assay方法。

　　(2)是否需要在以后的步骤里面去掉或者置换掉去垢剂？
去掉或者置换掉去垢剂是一件很麻烦的事情。因为很多去垢剂会形成胶
束结构，分子量非常大，所以没法用简单的透析或者超滤来去掉。比如大家常用
的Triton X-100和NP-40, 单体分子量是628,胶束的单体聚集数是140, 所以胶
束的分子量有87KD了,这显然是没有办法用透析来去掉的。相比之下CHAPS单体
分子量615,聚集数是10, 胶束分子量只有6KD,用透析就很容易去掉了。

(3)是否需要在以后的步骤里面用到离子交换层析或者疏水作用层析？
　　　离子型去垢剂会与相应离子交换柱结合得很好，干扰蛋白质的纯化。所以
如果要用到离子交换柱，要用非离子型或者两性离子型的去垢剂。另外，由于去
垢剂有疏水基团，一般用了去垢剂之后，就不应该在后续步骤里采用疏水作用层
析的方法了。　　　

　　(4)如果在后续步骤中选用凝集素层析, 选用的去垢剂是否构成干扰？
　　凝集素是一种植物中提取的一系列可以与糖基结合的蛋白。因为很多膜蛋白
都有糖基修饰，凝集素层析可以利用这种性质来纯化一些膜蛋白。类似与Octyl
Glucoside的去垢剂，亲水基团是糖或者糖的衍生物，有可能与凝集素结合，降
低凝集素的纯化效果。比如ConA agarose常常被用来纯化具有High-mannose
type　N-glycan的蛋白质，与mannose和glucose都能结合。如果此时用Octyl
glucoside，就无法纯化蛋白了，因为Octyl glucoside的亲水基团是一个glucose。

　　(5)是否需要用弱的去垢剂来去掉soluble protein?
有时候用去垢剂并非完全是用来溶解膜蛋百，其实也可以用来去掉一些可
溶蛋白杂质。比如Sodium cholate是一种很弱的去垢剂，虽然不能用来很有效
的溶解insulin receptor之类的膜蛋白, 但是可是用来处理plasma membrane
prep, 去掉大量的可溶蛋白杂质。

(6)是否需要用去垢剂来做Two phase partitioning？
　　Triton X-114是一种很特别的去垢剂，在室温下很容易溶解在水中，但是
在３０摄氏度以上会从水相中脱离出来，并且连带的把膜蛋白也一起拽出来。这
样呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分开。这种方法叫做，two phase partitioning。
我并不太喜欢这种方法，因为有一组人做了这个实验，感觉分得并不是那么干净，
在可溶相还是有不少insulin receptor。

　　(7)去垢剂的用量是否足够?
要充分的溶解膜蛋白，去垢剂的用量必须足够才行。我们在试验中，先测
了一下起始样品的蛋白总浓度，然后以detergent : protein 5:1的比例加去垢剂。

　　(8)选用的去垢剂是否影响所纯化蛋白的活性？
有些情况下，某些十分娇贵的蛋白质对一些去垢剂很敏感。问题是,很难
预先就知道那种去垢剂会降低蛋白活性。但是，我觉得大家至少得意识到，去
垢剂很有可能干扰蛋白活性的。我举一个例子。我是做糖基转移酶的。有一种
酶叫Protein O-mannosyltransferase 1 是一种膜蛋白，跟muscular
dystrophy有关系，是一个研究热点。很多实验室都怀疑这种蛋白是糖基转移
酶，但是很长一段时间里面，很多实验室发现表达的重组蛋白都没有活性。一
直到前两年，终于有一个实验室证明了这个蛋白是有活性的。之所以很多实验
室之前都不成功，其中一个重要因素就是去垢剂。Triton X-100和NP40是很
常用的去垢剂。这个成功的实验室发现，如果用常规浓度下的Triton X-100，
表达的Protein O-mannosyltransferase完全没有活性，相比之下用了Octyl
thio-glucoside就有活性了！所以呢，如果大家试图表达一个膜蛋白，却没有
活性，不妨换一下去垢剂，说不定会有意外的惊喜。

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