发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十八）
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jun 27 17:24:41 2005)


本文献给YL

（十八）凝集素层析

　　我们用去垢剂溶解了膜蛋白之后，紧跟着的一步就是用Wheat Germ
Aglutinin(WGA) agarose来部分纯化insulin receptor。WGA是凝集素
(Lectin）中的一种，而Lectin指的是可以与糖基结合的蛋白质。现在常用
来做蛋白质纯化的凝集素绝大部分是从植物中提取出来的。绝大部分膜蛋
白的extracellular domain和分泌蛋白都有N-linked glycan 的糖基修饰。
根据这个性质，用固定有适当的凝集素的beads，比如WGA agarose或
者ConA agarose可以部分提纯膜蛋白。注意，只能是部分提纯，凝集素
层析并不能一步登天，让蛋白质比活力一下子提高上千倍，至多几十倍就
已经很不错了。但尽管如此，凝集素层析是一种很好的办法，因为buffer
条件非常温和，洗脱液是加了糖的buffer，透析什么的也方便，非常非常
适合于和其他层析方法偶连起来用。

　　 纯化膜蛋白用的最主要的两种凝集素是WGA和ConA。谈到这里，
我先向大家介绍一下N-linked glycans。N-linked glycans是哺乳动物细
胞中最常见的一种糖基修饰。这种糖基是加在膜蛋白的extracellular
domain 上面。如果膜蛋白有这个sequence, N-X-S/T , 最前面的
Asparagine多半被N-glycan修饰。N-glycan是一个Oligosaccharide
结构，好像一个分叉的树枝一样。膜蛋白的新生肽链在被翻译合成的同时
会被直接塞入ER lumen，同时就会被加上一整个树枝状的N-glycan core。
这个N-glycan加上去之后，并不是就大功告成了，而是要经历一系列“裁减”
，有的糖基会被去掉，新的糖基又会被加上，这样最后的N-glycan
structure往往是千奇百怪。但是N-glycan的“主干”都是相似的.


Man 　　　Man
\ /
\Man/
|
GlcNAc
|
GlcNAc
|
N-X-S/T

Man代表Mannose甘露糖，而GlcNAc代表N-乙酰葡萄糖胺.



保留在ER或者Cis-Golgi的膜蛋白,N-glycan往往是High-mannose
type。在这种N-glycan的末端有很多甘露糖(mannose)修饰。最适合于
纯化这种蛋白的凝集素是ConA。ConA主要识别alpha-mannose,
alpha-glucose和alpha-GlcNAc,所以可以这三种糖溶液来做洗脱液。分
泌出去的蛋白，或者已经到细胞表面的膜蛋白的N-glycan往往是complex
type。这种complex type N-glycan的末端往往修饰有Sialic acid（唾液
酸，一种带负电的糖）和GlcNAc。而WGA主要识别GlcNAc和Sialic
acids，所以特别适合于纯化这种类型的蛋白，洗脱液可以用GlcNAc和
Sialic acid溶液。

　　　最后需要指出来是，纯化一种特定蛋白，选择用什么凝集素是完全
经验性的，需要提前测试才知道的。　

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