发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（十九）
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jun 28 12:36:26 2005)


本文献给YL

（十九）MDA-BF-1的启示

凝集素层析实际操作起来很简单，跟过简单的Ni柱子一样。拿到洗脱
的蛋白之后，我们就着手开始测活，分析纯化的效率和倍数。胰岛素受体
不是酶，所以测活是利用胰岛素与受体的特异结合。具体的测活步骤非常
简单，就是把I-125标记的胰岛素和纯化的组分混合然后孵育一段时间。然
后加PEG（Poly ethylene Glycol ) 6000沉淀胰岛素受体，而游离的胰岛
素不会被沉淀下来。说到PEG沉淀，Dr.Lin讲了她自己闹的一个笑话。是
这样的，她实验室发现了一个蛋白质因子 MDA-BF-1。这个因子对Osteoblast
（成骨细胞）的增长有促进作用。然后呢，她就想把这个因子的受体给找
出来。首先一步呢，就是得有一个测活方法。所以她就比照insulin
receptor的测活方法而设计了一个方法, 其中连PEG沉淀都是一样的。
结果呢，这个测活试验完全失败了。问题出在PEG沉淀这一步。PEG作
为一种多元醇，可以想像为一种“分子海绵”，可以吸附水分子。这样样
品中蛋白的有效浓度实际变大了好多，容易出现聚集然后沉淀的现象。
这就是为什么insuline receptor可以被沉淀下来的原因。而游离的胰岛
素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，
也沉淀不下来。而Dr. Lin发现的MDA-BF-1因子，分子量相对insulin大了
好多，有50多KD，所以游离的因子也能被PEG沉淀下来。听完这个小插
曲，我感觉挺吃惊，作为一个有经验的教授，Dr.Lin在没弄清楚原理的情
况下竟然就胡乱套用protocol 。所以呢，我感觉做实验，仅仅是follow
protocol把实验完成了，是远远不够的。一定得搞清楚原理是怎么回事，
这样出了问题才知道怎么去改进。

MDA-BF-1不仅仅给我以上的启示。Dr.Lin给我们做了一个seminar，
讲述她的研究进展。其中她重点谈到了MDA-BF-1这个因子。她实验室现
在正在做的是试图用蛋白质纯化的办法来找出MDA-BF-1的受体。她的测
活方法是这样的，首先表达MDA-BF-1的重组蛋白，然后用同位素标记，
然后做binding assay。这个binding assay 很麻烦，因为没办法用简单
的手段把游离的MDA-BF-1和与受体结合上的MDA-BF-1分开，只能用gel
filtration column来分开，每做一次assay都很麻烦。虽然Dr.Lin提到她们
还没有找到那个受体，我个人觉得这个方法不是很明智。为什么呢?纯化
蛋白的过程中，各种膜蛋白都处于一种被去垢剂溶解的匀浆状态，这种情
况下，一些正常生理条件下不会与MDA-BF-1结合的受体可能也会与其结
合。这样一来，纯化出来的东西就是乱七八糟的了。另外一种可能性是:
有很多膜蛋白能与MDA-BF-1相互作用，但是只有一种膜蛋白能够启动下
游的信号传导，促进Osteoblast的增长。这种binding assay的测活方法
虽然可以找出与MDA-BF-1结合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能
根本没有信号传导的功能。需要强调的是，蛋白质纯化绝对不是万能的。
要想纯化出一个未知蛋白，最最重要的是要有一个简单明了直接的测活
方法。Dr.Lin 实验的问题，说到底，就是没有好的测活方法。

　　这一个模块的纯化试验到此就为止了。我们测活之后，比较了各种去
垢剂的纯化效率，发现Triton , CHAPS, Octyl Glucoside都还比较好，
Sodium Cholate则差好多。

原始的实验手册上还有进一步的insulin affinity chromatography和
其他分析。而教员为了满足很多学生做做重组蛋白表达纯化的愿望，用一些
比较白痴的的实验取代了原有很经典的实验。比如一个实验是从SF9里面纯
化一个his tag的蛋白&%$&$#$#!!! 我知道要做这个试验之后，几乎要抓
狂了。我这一组其他几个人还把这个试验当宝，抢着做。而我最后选择去
跑了一个2-D gel。就这样，第三个模块的实验结束了。


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