发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（二十）
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jun 30 23:55:37 2005)


本文献给YL


（二十）钙调蛋白

　纯化胰岛素受体的模块结束之后，我们这一组人进入到最后一个模块，
做钙调蛋白的纯化和分析。钙调蛋白(Calmodulin)十分重要，几乎在所有
真核细胞里面都能找到。这个蛋白只有148个氨基酸，大概16KD，比较
小。有Ca2+结合的情况下，钙调蛋白的构象可以发生较大的改变，从而激
活一系列酶的活性，比如cyclic nucleotide phosphodiesterase, 一些
protein kinases, phosphatases 和ATPase等等。这一个模块的实验中，
我们是从鸡胗里面提取和纯化钙调蛋白，然后再做一些分析。

这一个模块的纯化设计，可以说是最大限度的利用了钙调蛋白的特殊
性质，我觉得设计的很精彩。不过我对这个模块的实验经历并不是很满意。
教员的实验助手只有一个人，而且非常不称职，对实验本身似乎不太了解，
也不是很helpful，感觉比前几个模块的实验助手差多了。教员叫Constantin，
是一个俄罗斯人，在rutgers当教授。我起初对他印象不佳，后来发现这个人
其实很nice,非常和蔼。
　　
整个纯化步骤大概是这样的。首先把鸡胗剁碎匀浆，然后做粗分离，
用硫酸铵沉淀的办法把杂蛋白都沉淀下来。然后再做等电点沉淀，把
Calmodulin沉淀下来。重溶沉淀之后再做透析来脱盐。然后再过阴离子
交换柱DEAE Sephadex A-50。纯化出来的组分再过疏水作用层析柱，
就可以得到很纯的Calmodulin了，用Commassie blue都可以染出来。

　　我们做的实验中没有对Calmodulin的测活实验，可能是因为最后纯化
出来的Calmodulin很多,可以做光谱分析之类的实验进行分析，所以就省
掉了。但我多少有一点本末倒置的感觉。因为对未知蛋白质纯化，首先就得
有一个靠的住的测活方法, 然后才能逐渐制定最优化的纯化策略。另外，
在设计测活方法之前，还必须搞清楚，有生物活性的物质是不是蛋白质。
一般有下列几种方法。(1)对protease的是否敏感。(2)生物活性不会因为透
析而丢掉(3)Urea之类的变性剂是否降低生物活性(4)对化学修饰剂(比如
sulfur hydryl blocker idoacetamide)是否敏感。

我们提取钙调蛋白所用的组织原料，鸡胗，量挺大的，有一斤之多，
红红的一大堆肉。这样的组织，匀浆是一件很麻烦的事情，所以我们用了
一个大号的匀浆机，试图把肉都捣烂。但是效果不好，重复了两次，还是
有很多肉没有被弄碎，所以只好扔掉了。值得强调的是，对于这样大量组
织的匀浆，缓冲液的配方必须有所考虑。首先，离子强度要低一点，高离
子强度容易导致蛋白质聚集和沉淀；其次，最好加如EDTA之类金属离子螯
合剂。这是因为组织里面会有很多二价阳离子，有可能会与组织里面的一
些无机盐（比如磷酸盐）反应产生沉淀，导致匀浆中蛋白质不能完全溶解。
最后，如果要在后续步骤中过阳离子交换柱，要避免有primary amine的
缓冲物（比如tris），如果要过阴离子交换柱，则要避免用磷酸buffer。

我们拿到匀浆之后，然后过滤。接着的一步就是硫酸铵沉淀。硫酸铵
沉淀的原理我前面提到过，所以就不多说了。我们用了饱和硫酸铵浓度
（６０％）来沉淀。 钙调蛋白这个东东很奇怪，没有钙离子结合的情况下
很亲水，所以即使用饱和硫酸铵，也沉淀不下来。但大量的杂蛋白都能被
沉淀下来。当然也不是所有的杂蛋白，至少血红蛋白就不行，因为硫酸铵沉
淀后的上清还是红色的。下一步呢，就是等电点沉淀。钙调蛋白是一个很酸
的蛋白，等电点只有4.05，所以可以加硫酸使pH降到4.05附近，蛋白总电
荷为零，就容易聚集沉淀。我的感觉是，等电点沉淀并不是很可靠的方法，
因为很难保证沉淀过程中蛋白会不会变性。搞不好，蛋白沉淀后就没法重溶
了。钙调蛋白溶解性比较好，也比较皮实，重溶起来比较容易。重溶用的是
Tris的溶液，由于这个时候样品溶液里面盐浓度很高，不能直接上样到下一
步的离子交换柱上，所以需要透析。我们先把样品放到蒸馏水中透析两三个
小时，然后再换到一般的缓冲液里。透析大家估计都熟悉，也没有什么技术
含量。只有两点值得注意，首先，透析袋不能装满，因为透析过程中样品体
积会增加。其次，透析袋空的地方要弄瘪，不能留空气，否则样品体积增大
后，扎紧的透析袋可能会受压而破裂。

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