发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（二十一）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jul 1 20:22:47 2005)


本文献给YL

（二十一）离子交换层析


　做完硫酸铵沉淀以及等电点沉淀之后，下一步就是做离子交换层析
(ion-exchange chromatography)。离子交换层析原理很简单，利用蛋
白质表面的带电基团和resin上带相反电荷的ion exchanger group相互结
合来纯化蛋白。离子交换柱和affinity chromatography一样，属于
absorption/desorption型的层析方法，与gel filtration完全不一样，其中
一个最大的优点是，样品体积可以很大，最后的洗脱样品的体积可以小很
多，这样实际起到了一个浓缩样品的作用。还有一个优点是，离子交换层
析其实不需要柱子，可以用batch 的方法（在离心管里面混合beads和样
品）。当然如果beads量多情况下，batch方法平衡得不是很好，导致
resolution不是很好。这一点我们做实验的时候深有体会，以后的一篇中我
会提到。我们纯化钙调蛋白用了柱子做纯化，原因是因为所用的beads 相
当于Sephadex G-50再加上阴离子交换基团，所以实际上可以看成是
ion-exchange和gel filtration 的混合体。Calmodulin分子量比较小，所
以很容易和分子量大的杂蛋白分开。

离子交换柱分为阳离子交换柱和阴离子交换柱，前者主要用来纯化偏
碱性的蛋白质，后者则用来纯化偏酸性的蛋白质。绝大部分蛋白都偏酸性，
所以阴离子交换柱用得更加普遍一些。常用的阳离子交换剂主要有
Carboxymethyl 和sulfopropyl两种。Carboxymethyl比sulfopropyl要弱
一些，所以同样的蛋白与这两种基团结合，后者的洗脱盐浓度得高一些。
常用的阴离子交换剂有DEAE(diethyl aminoehtyl)和Quaternary amine
两种。后者比前者强，适用的pH也更宽。选用何种离子交换剂要根据实际
要纯化蛋白的性质来决定。比如我们纯化钙调蛋白就用的是弱的阴离子交
换柱DEAE，因为前面我提过，钙调蛋白的pI很低，蛋白很酸，与弱的阴离
子交换剂也能结合得很好。而很多其它的杂蛋白没有这么酸，所以结合不
上。这样，用DEAE实际上可以有效的除去很多杂质。

　　离子交换柱真正跑起来时非常简单，没有什么技术含量，但是第一次纯
化一种蛋白的时候，一定得先摸清起始条件。

　　首先要确定用什么缓冲液。缓冲物由于自己带电，所以也可以与
ion-exchanger结合。这种结合会带来两方面的干扰，一个是降低了缓冲物
的浓度，因而降低了缓冲能力，另一个是与蛋白质竞争ion-exchanger。所
以呢，如果用阴离子交换柱，要避免用磷酸buffer之类的带负电的缓冲物，
如果用阳离子交换柱，则要避免用Tris buffer之类的带正电的缓冲物。有的
缓冲物是两性离子(zwitterionic)，比如HEPES，所以阴阳两种离子交换层析
都适用。如果待纯化的蛋白是膜蛋白，要用去垢剂，则应该选用非离子型或
者两性离子型的去垢剂，道理跟上面是一样的。

　　第二个要注意的起始条件是pH。有些时候要分离的蛋白的活性对pH非
常敏感，所以pH没有太多选择。但很多情况，应该根据待纯化蛋白的性质
而进行选择。以阴离子交换柱为例，如果蛋白结合得不好，可以提高一下
pH,　如果蛋白结合得太紧，需要高盐洗脱的话，则应该降低一下pH。要确
定最适合的pH，可以做一个简单的小实验（以阴离子交换柱为例）。配pH
从5.0到9.0，间隔为0.5的一系列缓冲液。用这些buffer先把beads平衡好
了，然后向每一种pH平衡好的beads里面加一小等分的样品。孵育之后，
取上清测活。如果蛋白质结合上去了，上清的活性就没有了。然后，取比活
性刚刚开始结合的pH高0.5单位的pH作为离子交换层析实验的pH。注意，
这里pH不是越高越好，pH太高，杂蛋白也能结合上，会降低ion-exchanger
的capacity。

　 确定了buffer和pH, 下一步要确定的是上样时的起始离子强度，也就是样
品起始盐浓度。用来确定盐浓度的小实验是这么做的，配一系列盐浓度从
0.1M到1M（间隔0.1M)的缓冲液。用这些buffer平衡beads，　然后加入
一小等分的样品，孵育之后，取上清测活。低盐浓度下的上清应该没有活性，
因为蛋白可以与beads结合，较高盐浓度下，上清中应开始出现活性。然
后选择刚刚低于洗脱蛋白所需盐浓度的浓度作为样品的起始盐浓度。这样做
的好处是, 一些与ion-exchanger结合较弱的杂蛋白，一开始就不会结合到
beads上去。另外，实际跑样品之前，如果样品体积比较大（比如数百毫升）
，必须测一下电导率以确定起始盐浓度符合要求。如果低了，就应该加盐，
高了，就应该加水。　　　　

--

※ 来源:·BBS 未名空间站 http://mitbbs.com·[FROM: 130.245.203.56]