发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（二十二）
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jul 2 10:31:53 2005)


本文献给YL

　（二十二）失败中的启示

　　离子交换层析之后是最后一步纯化，疏水作用层析(hydrophobic
Interaction Chromatography, HIC)。HIC和硫酸铵沉淀是同一个原理。
蛋白质表面有一些疏水区域，如果在蛋白质样品溶液里面加足够的盐，
就会与这些疏水区域争夺水分子。没有了足够的分子，这些疏水区域倾向
于与其他疏水区域结合。HIC的beads上衍生有非极性基团，可以与蛋白
质的疏水区域结合，这样蛋白质就能bind到柱子上。要想把蛋白质洗脱
下来，则要用低盐缓冲液冲洗，盐浓度下降之后蛋白质与柱子的疏水相互
作用也被削弱，所以能被冲洗下来。由于HIC要求样品的起始盐浓度很高，
所以特别适于作为硫酸铵沉淀或者离子交换层析后续步骤。因为硫酸铵沉
淀（无论是上清还是沉淀）和离子交换层析的产物，盐浓度都非常高，如
果直接再跑HIC，不但省了透析脱盐的一步，还进一步纯化了蛋白。现在
常用的HIC resin上的疏水基团有两种，一种是Phenyl 另一种是Octyl。比
较而言，Octyl group更加疏水一些。我们这一次的实验中用的是Phenyl
sepharose。值得强调的是，对于HIC而言，resin的衍生基团并不是越疏
水就越好的。因为如果太疏水的话，与蛋白质的结合会十分紧密，以至于
要加入有机溶剂，才能冲洗下来。但是有机溶剂同时又有可能使蛋白变性。

　　疏水作用层析特别适用于纯化钙调蛋白。因为钙调蛋白在有钙离子结
合的条件下，高度疏水，即使在低盐浓度下也可以很牢固的与HIC column
结合。洗脱钙调蛋白时，用含有EDTA或者EGTA的缓冲液。失去钙离子的
钙调蛋白疏水性会降低很多, 这样很容易被冲洗下来。

HIC这一步，我感觉要比前一步离子交换有用的多。为什么呢，这要
从我们一组实验中的失败说起。跑DEAE柱子需要我们自己装柱，大小跟过
去跑S-300柱子差不多，装好柱子之后我们就开始上样。起初这个柱子没什
么问题，但在样品快要上完的时候，不知为何柱子里面大量的beads漏到
了柱子的玻璃保温夹层里面。我们一看大事不好，只好把柱子停了，然后
把beads全掏了出来，准备用batch的方法来洗脱蛋白。我们用了一个
tissue culture过滤media的过滤器来做这件事情。beads 放在过滤漏斗
里面，加含盐的缓冲液搅拌洗涤，然后抽真空让液体过滤出来。按道理，
绝大部分钙调蛋白应该被0.9M NaCl的buffer冲洗下来。但是我们又发生
了意外，冲洗的过程中过滤器被碰倒了，beads和洗脱液撒了一桌子！眼
看要成功了，竟然发生这种倒霉事情，全组人都很depressed，都有一种要就
义的感觉。教员Constantin比较有经验，他要我们把0.9M NaCl之前的低
盐洗脱液混在一起直接做下一步疏水作用层析。这样一来，我们等于绕过了
离子交换这一步。最后纯化纯化出来的蛋白让我们大吃一惊，不但非常纯不
说，总量大概有几十个毫克，跟手册上给的通常产量差不多。这个结果说明
一个问题，就是离子交换这一步虽然看起来很fancy，但对于钙调蛋白的纯
化并不是那么重要。蛋白质纯化的步骤并不是越复杂越好，简单，快速，便宜
的步骤才是最好的。


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