发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（二十三）
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jul 5 00:24:35 2005)


本文献给YL

（二十三）正相与反相

　　我们纯化出钙调蛋白之后，就开始进行一些蛋白质化学的分析。主要是蛋
白酶消化，反相HPLC分析，MALDI-TOF质谱之类的分析。我觉得在这个课程
里面加一个质谱分析并不是那么有用，因为基本上只是演示实验，只是讲了讲
皮毛而已。相比之下反相HPLC在蛋白质纯化中要重要得多。

　　HPLC的全称是High Performance Liquid Chromatography （高效液
相色谱），这个名称听起来好像很尖端的样子，其实HPLC组成部件非常简单，
主要是三部分，泵，柱子，和UV monitor。反相HPLC跟一般的色谱的一个显
著不同是压力。为了保证纯化蛋白的分辨能力，反相HPLC柱的matrix材料颗
粒非常精细，所以必须施加很大的压力才能跑得动柱子。相比之下，反相HPLC
所需压力比一般gel filration柱子压力大十倍都不止。反相HPLC的分辨度十分
惊人，远远超过其他色谱方法。分辨度高到什么地步呢，我举一个自己的例
子。我原来在E.Coli里面表达EGF repeat，大概有7到8KD的样子，然后用体
外反应加上一个fucose糖基。这个fucose分子量只有146。就这么小的区别，
即使跑在SDS-PAGE上也是看不出来的，但是用反相HPLC可以很完全的把没
有糖基和修饰上糖基的EGF repeats分成两个峰。可见反相HPLC有多么强大了。

反相HPLC虽然很强大，但是它最大的弱点是不能用来分离大的蛋白，只
能用来分离小肽或者小蛋白（比如histone）。具体说起来，大于30KD的蛋白
就可能不行了。原因是洗脱相里面用得是有机溶剂，容易使大蛋白，尤其是带
有很多二级结构的蛋白变性。

反相HPLC为什么叫反相(reverse phase)呢? 这其实跟正相(normal phase)
HPLC有关系。正相HPLC依靠提高流动相的极性来洗脱。而反相HPLC则相反，
依靠降低流动相的极性来洗脱。正相和反相HPLC柱子的材料都是由silica gel
（硅胶）构成的。反相HPLC柱子的silica gel上面还有衍生的alkyl group，所
以疏水性强了许多。正相HPLC一般用来分离脂类分子。脂类分子有少许极性，
如果样品溶解在有机溶剂里面，再过柱的话，可以与柱子的silica gel结合上。
如果在流动相里面逐渐提高极性成分，脂分子就会被洗脱下来。反相HPLC则
是用来分离蛋白质的。蛋白质有部分疏水性质，过反相柱的时候，可以与silica
gel上的alkyl group相互结合。但是如果在流动相里面逐渐提高非极性成分
（比如acetonitrile），蛋白质就会被洗脱下来。

　　大家可能注意到，反相HPLC的原理和疏水作用层析的原理很相似。但是，
反相HPLC里面的蛋白质与柱子的疏水作用比一般疏水作用层析要强得多。原
因就在于反相HPLC流动相中含有TFA（三氟乙酸）。TFA是一种强酸，所以能
很有力质子化蛋白质中的羧基，是之不带负电。同时又能与蛋白质中正电基团
形成离子对，进一步增加蛋白质与柱材料的疏水相互作用。

　　反相HPLC具体跑起来很简单，主要是操作仪器，先把蛋白质样品和0.1%
TFA的溶液混合一下，然后上样，用0.1%TFA冲洗若干分钟，使得蛋白样品和柱
子结合上。然后逐渐增加流动相中的acetonitrle（乙晴）浓度，洗脱蛋白。

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