发信人: tiangeng (田大榜), 信区: Biology
标 题: Re: 融合表达蛋白初级问题求解//BOW！！！
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Oct 16 14:21:08 2005), 转信

翻老帖子发现你的帖子没人回.
你的理解可能有些问题.
没有特殊情况,酶切-连接后,酶切位点仍然完整.
所以设计引物的时候一般不用担心酶是如何切这个位点的.
就想象你克隆的这段直接插到酶切位点之后.
另一方面因为你是在做N端的融合,这时候要考虑的是你的克隆片断
和载体上原有的tag蛋白的in frame的问题.
不能只想着酶切位点.
你好像在用4T-1的NotI的位点.
根据这个图:

这时候在酶切位点后面应该再加两个碱基才能in frame.
关于ATG你是对的,不过还要多考虑一点,就是你的蛋白atg这段很可能是信号肽.
做e.coli表达,我的体会是,这段不但不需要,而且会添麻烦.
我一般用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/来找到信号肽切点,
N端融合的话我就从切点之后开始克隆.C端融合的话,我就要保证一个
有一个in frame的atg在前面.


【 在 polystudy (polystudy) 的大作中提到: 】
: 目前，困境中，恳请牛仁指点，本人是菜鸟，非生物专业，
: 自己胡乱看了点初级的课程， 想的不对，请给条明示。
: 不胜感激~~~~
: DNA 序列头尾如下：
: ATGGCGGTAAATCCTGAGTTAGCACCGTTCACCCTCTCGAGAG
: 。。。。。
: AAAGGGTAACCAAGTTATCATCGATGAATTACAAAAATGTCATATGCAAGAATAA
: 要扩全长，并且把它融合到pGEX 4T-1 载体上去，该载体可以产生GST TAG.
: 所得到的结构为 GST TAG---PROTEIN.
: 对ORF的移动问题很不清楚，哪位给分析一下：
: ...................


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