发信人: ader (阿德), 信区: Biology
标 题: Re: help!a question on cloning!
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Nov 11 23:28:31 2005), 转信

不用try了，PCR cloning kit都是带接头的，自恋率非常高。
pCRZeroblunt带蓝白斑鉴定，用IPTG-Xgal，但是topo自连的地方会修复，
有假阳性。
3.5K连16K很不理想，我不喜欢超过3倍长度。
这个kit更不理想，我一般宁可用自连的阴性plasmid stock,
EcoR V blunt他。我测试ligase的blunt连接就这么玩的。
Roche的T4就这么都连不上。我实在很景仰他的特异性。

凭感觉，连接片段长度在2倍内比较好，一般是载体长点，方便SAP处理。

做cloning，plasmid是target,也是你的工具啊，没什么好偷懒的，
没有大于10K的，自己建，下次就有了。
到美国来的，没有人带质粒库大搬家的，反正是老板的事，你又不是老板。
你帮老板省钱，那是给他面子，否则是应该的。

尽量对你原来16K片段所在的质粒打主意，哪怕搞出一端sticky end，
连接效率也会dramatically提高。
我到美国最开心的就是，RE,SAP,ligase所有效率太太太太高了，买个competent,
做实验比在中国做老板还舒服。

//也不要太早开心，一旦cloning让老板感觉很easy了，他会很push你的。
这是politics，玩的时候，也经常遇到他。
Good Luck.

【 在 apple12 (apple) 的大作中提到: 】
: I used Invitrogen pCRZeroblunt end ligation kit. The T4 ligase is provided
by
: the kit. My
: ligation have hundreds of colonies. I may try isolate all of them.
: I don't have a plasmid with >10k insertion.


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