发信人: rab (rab), 信区: Biology
标 题: Re: fluorescence 的fix问题
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Nov 30 18:19:49 2005), 转信

呵呵，换了fixative，用丙酮，强点，但是没有根本性的不同。

增加uptake量是正点。今天找隔壁实验室的一个教授请教，他的说法是，我的protein
solution 本身浓度就不够高，实验中却还稀释了几百倍（因为我老板说稀释一千倍还有
一吨, a ton).这么一来，我先前做的浓度曲线根本就是无效范围内的，没有意义。今天
蛋白没稀释就直接apply上去，fix 10分钟，信号强得不得了。呵呵。

嗯，还是思维太局限啊。

谢谢所有给了建议的同志们。


【 在 Ras (很颓的猪。) 的大作中提到: 】
: 标 题: Re: fluorescence 的fix问题
: 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Nov 28 20:52:34 2005), 转信
:
: 换fixation reagents吧。 多试几种。
: 再不行就增加uptake的蛋白量？
:
: 还不成的话，能不能这个uptake的蛋白也改成做indirect IF?
:
:
: 【 在 rab (rab) 的大作中提到: 】
: : 标 题: fluorescence 的fix问题
: : 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Nov 28 20:49:11 2005), 转信
: :
: : 最近做一个immunofluorescence的实验，一个alexa 568 conjugate的protein, 被细
胞
: : uptake。因为我要比较这个uptaken的protein跟另外一个endogenous protein的
coloca
: : lization,那个endogenous protein只能用通常的fix/permeabilization/1 Ab/ 2 Ab
.
: :
: :
: : 看见不少报道都说多数荧光分子都可以survive fixation的，我的结果是只要fix一
下(
: : 3% PFA, 5min),荧光信号就弱得不得了。有时候根本就没有。按照常规的20min fix,
荧
: : 光就根本没有。 同志们有谁有经验的，给点拨一下吧。多谢了。
: :
: : 对了，我做的是tissue. 见过的成功报道多数是培养细胞。alexa488也试过，一样。
fi
: : xative是formaldehyde 或者paraformaldehyde.
: :
: :
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