发信人: piggee (广东语文科代表兼著名YAO-FAN), 信区: Biology
标 题: Re: 为啥RNA的transcription老是重复性不好
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Apr 9 12:25:10 2006)

1。 DNA量要够。
2。 质粒要LINEARIZE。
我用PROMEAGA的SP6做过。说是可以不用LINEARIZE，但如果不切做不出来。选酶切之前一
定要查过不要把你的ORF切了
3。 加RNAin
我做过很多RNA从来没有被RNase污染过哪怕我做得很随便。也许是运气好。理论上一旦
RNase污染就什么都没了。这情况好像很多人SUFFER过。
4。你的重复性好什么意思。
你怎么QUANTITATE你的RNA产物。
我都没有32P标记。只是一般的INVITRO TRANSCRIPTION，然后跑FORMALDEHYDE GEL用溴化
乙定燃就看到具CRYSTAL的带。然后对比LOADING CONTROL来QUANTITATE。
我在跑胶前，先DNASE DIGEST掉DNA模板。然后用QIAGEN的RNA EASY CLEAN KIT提纯RNA
ELUTE大概是30-60 微升产量是30-120微克。
然后我是用来作IN VITRO TRANSLATION 得。 35S 标记。我一次得到的RNA量够实验室用N
年了。
对了我们的PROTOCOL是TRANSCRIPTION 37度 3个半小时。
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