发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记（八）
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jul 15 20:34:20 2006), 转信


　本文献给YL

（八）Matrix Reloaded

　　　六月七号第一天实验中最重要的一个项目是胚胎子宫转移（uterine transfer）。
这个实验的目的在于把经过体外培养和修饰过的囊胚（blastocyst）放回到假孕小鼠的子
宫里，使之着床（implantation）并且正常发育。没有这个技术存在，基因敲除小鼠是绝
对做不出来的。前面提到过，Anne Mclaren一手发展了这个技术，奠定了小鼠胚胎研究的
基础。原始的文章发表在Nature上，有兴趣的同学可以查阅一下：McLaren A. and
Biggers J.D. 1958. Successful development and birth of mice cultivated in
vitro as early embryos. Nature 182:877-878。

　　　把囊胚（blastocyst）放入子宫（uterus）本身并不能保证囊胚的正常发育，只有
当囊胚正确的着床（implantation）之后才能进一步发育。而顺利的着床（implantation
）需要怀孕雌鼠在特定时间“窗口”大量分泌一些激素。由于这种激素分泌“窗口”非常
短暂，为了不错过这个“窗口”，必须把3.5dpc的囊胚转移到2.5dpc而不是3.5dpc的假孕
小鼠。 “Manipulating the Mouse Embryo: a laboratory manual”介绍子宫转移的
protocol中没有怎么强调这个时间的问题，但是我觉得这一点很重要。

　　　现在我来介绍这个实验技术。首先给代孕的小鼠腹腔注射麻醉剂avertin，让它睡
着。然后把小鼠放在一叠粗糙的纸巾上，开始找寻适当的切口位置，把卵巢和子宫拉出来
。怎么寻找切口位置呢？由于这是所谓的存活手术“survival surgery”，可以想像要想
小鼠在手术后尽快恢复过来，这个切口必须离卵巢和子宫很近，并且不能太大。一开始做
这个实验的时候，我觉得找切口是个很麻烦的事情，后来做了几次就觉得简单多了。我觉
得关键是弄明白子宫和卵巢的大概在小鼠身体中的位置。前面一篇中我提到过卵巢和肾脏
通过卵巢脂肪垫连在一起。它们位于小鼠腹腔背面，贴在腹膜上面，离脊椎和胸廓（rib
cage）都很近。我们课程一个资深的教授Patric Tam教了我一个trick 来确定合适的切口
位置。以小鼠左侧的卵巢和子宫为例。首先让小鼠左半边身体朝上侧躺，用70%乙醇清洁
一下小鼠身体表面。然后用手触摸找到小鼠的脊椎和最下面（以头为上，尾为下）的一根
肋骨。这根肋骨和脊椎形成大概一个直角，在这个直角下面一点（大概一厘米），紧靠脊
椎的地方，与脊椎平行的做一个大概半厘米到一厘米长的皮肤切口。注意，皮肤切口最好
不要太大。切开皮肤之后下一步要切开肌肉层和腹膜。由于肾脏什么的内脏紧贴着腹膜，
这一步要格外小心。我的做法是用精细的镊子把肌肉层什么拉起来，然后用解剖用的小剪
刀一点一点的剪开。这个开口不能太大，几个毫米就差不多了。腹膜被剪开之后，接着就
是把卵巢找出来，这样就可以轻易的确定子宫起始的位置了。卵巢本身很小，不好找，但
是卵巢的脂肪垫是很大的一团白色的东西，比较容易辨别。很多时候透过肌肉层就可以看
得到。这个时候用小镊子伸入腹膜切口，把脂肪垫拉出来。脂肪垫和肾脏联系不紧密，但
和卵巢联系比较紧，所以连带把卵巢，输卵管，和一部分子宫都拖了出来，以与脊椎垂直
的方向放在小鼠的身体上。然后用一个小牛头犬钳子（small bulldog clamp）夹住脂肪
垫，也放在小鼠身体上。这样子宫就不容易缩回去。

　　　实验到这里都可以在实验台上完成，下面是把囊胚转进子宫，必须在解剖显微镜下
完成。把小鼠转移到显微镜下后，第一步是要在靠近卵巢的子宫上扎一个洞。我们用的是
30gauge的针头。有同学可能会问，为什么不能更粗的工具戳洞呢？这是因为穿孔过大的
话，子宫很容易被弄烂，转移进入的囊胚就很容易再掉出来。另外在子宫上面有很多毛细
血管，一旦被戳破会弄得血肉模糊，用很细的针头就可以避免这一点。第一次做这个活，
感觉会困难。因为子宫很脆弱，用力过大，针头会把整个子宫戳穿。我试了好半天才做成
功。我的做法是左手用钝的镊子把子宫稍微拉一起来一点，然后右手拿针头与子宫近似平
行的轻轻扎入。这个时候拿针头的右手不能乱抖，否则针口就会被弄烂。一旦觉得针头进
入了子宫之后，轻而又轻用针头在子宫的管状结构里面试探，看能不能自由的移动。如果
可以自由移动的话，说明针头是在子宫里面，扎针成功了。然后把针头取出来。

　　　下一步是把载有囊胚的口吸管通过针口插入子宫里，然后把囊胚吹入子宫。实验作
到这里，按说很简单把。结果我发现了一个新问题。当我拿起载有囊胚的口吸管回到显微
镜下准备转移的时候，突然发现找不到针口了！因为针口非常小，一旦拔住针头，针孔就
看不见了，一点痕迹都没有。我第一次做的时候，没什么经验，只好硬着头皮用口吸管这
里戳戳那里戳戳，结果把子宫完全戳烂了也没找到原来的针口。第二次做的时候我就学聪
明了。我先把载有囊胚的口吸管挂在目镜上，然后扎针。扎成功之后，我用左手扶住针头
，使针头继续留在在子宫里面。然后用右手把口吸管吸口放在嘴里，然后再拿住口吸管的
吸管和针头放在一起。然后再把针头拔出来，同时把口吸管插入。这样就不会出现找不到
针口的情况了。插入口吸管的时候也要小心，避免把针口弄烂，同时也要轻轻的在子宫里
面试探，看是否能够自由的在子宫里面移动。一旦确定正确插入了，下一步就是把口吸管
里面的囊胚吹进子宫了。把囊胚吹入子宫是很容易的事情，只要注意两个问题就行了。一
个是有时候整个吸管会堵塞住，比如扎到了毛细血管，有出血现象的时候；另一个是要确
定所有囊胚都完全进入了子宫。尤其后一个问题要注意一下。有同学会觉得使劲把口吸管
中所有的东西都一古脑吹进去不就结了吗。但事实没这么简单，因为这样会给子宫带来很
多气泡，有可能降低囊胚最后着床（implantation）的效率。我的做法比较简单，在吸取
囊胚之前先吸上一部分培养液，记住此时液柱高度，然后再吸囊胚。注射囊胚进子宫的时
候，我的眼睛不看目镜，直接观察口吸管的液柱，然后用力吹，直到液柱高度降到吸囊胚
之前。这样可以百分之百保证所有的囊胚都能进入子宫。

　　　成功把囊胚注射入子宫后，就开始收尾了。把卵巢和子宫重新塞回到腹腔里面。由
于一开始的时候，肌肉层和腹膜的切口很小，只有几个毫米，所以可以不用缝合。只需要
用金属创伤夹（wound clipper）把皮肤切口钉起来就行了。然后把老鼠放回笼子里，过
十几天看老鼠是否怀孕就行了。

　　　课程第一天做了子宫冲洗和子宫转移之后，我感觉象脱了一层皮，觉得能勉强做出
来已经是侥幸了。可是，我万万没想到的是，第二天的实验比第一天的实验要难暴多，可
以说是mission impossible。


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