发信人: leohawk (leohawk), 信区: Biology
标 题: My suggestionRe: 熟悉果蝇的看过来，有个问题要请教
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Mon Sep 27 00:45:50 2004), 转信

this reminds me of my project, if you use P element to do the
deletion... it never worked for me, we got a lot of mutants and we
never figured out what happened... I did a lot of genomic southern
at the time trying to figure out.

we eventually used EMS, if this mutation is easy to score, do that.
you can get it in a summer (with the help of some undergraduates).

only problem is how do you prove it is a NULL...

good luck

【 在 iav (damn it) 的大作中提到: 】
: 弄了个deletion的突变，结果正好在两个基因中间，两个头对着头的基因，promoter
: 是共用的大概，只是方向不同。这个距离是~350bp,比较小。不过我只对其中一个基因
: 感兴趣。
: 采取的办法是，对这两个基因分别做rescue,加一个gene1+gene2的总rescue,由此想分离
: 出比较单纯的一个基因的突变表型。对了，忘了说了，几个deletion突变都是致死的。
: 我做rescue是用PCR的办法，得到大的DNA 片段，再转基因。一个是从基因上游-2kb到
: 下游+700bp,另一个是从上游-1kb到下游+500bp（这个是因为-1kb上游被delete了之后
: 仍然检测得到表达，所以没有取太长的上游序列）.总rescue是两个远端之间都包括，
: 从头到尾将近8kb,分别包括了两个基因上游3kb和5kb。
: 象下面这样：
: -----------------------------5'-########-3'----------
: ----------3'-#############-5'------------------------
: 1. =======================
: 2. =========================
: 1+2. =================================
: 完了之后做注射得到转基因果蝇，都没有问题。然后问题来了，我最痛恨这种方式了---
: 早不出毛病，到最后一步出毛病，结果是三个transgenic constructs都没有rescue.
: 我的问题是，我的rescue片段可能不够大，但是2kb的上游片段是不是应该足够？有人
: 做的很长，>5kb的，也有paper说700bp就行的。我自己以前就按2kb做（不同的基因）是
: 可行的。一般到底多大才足够？ 麻烦还在于，一点rescue的迹象都没有，比如partial
: 的，果蝇死得不那么早。
: 还有一个是，lethal的mutation, 做rescue是不是更困难一些？有人说lethal gene一般
: promoter/enhancer会比较强。
: 辛辛苦苦三个月啊，从克隆到转基因果蝇，他妈的。
: 大伙给个建议，谢了先。


--
※ 修改:．leohawk 于 Sep 27 00:46:41 修改本文．[FROM: 68.38.]
※ 来源:．Unknown Space - 未名空间 mitbbs.com．[FROM: 68.38.]